显微镜检查是微生物室技术人员的最基本技能。其敏感性和特异性虽不如培养法，但显微镜检查简单、快速、经济、方便，根据一些病原菌的形态特征，可做出初步病原学诊断，为临床早期抗感染治疗提供依据，也是进一步菌种鉴定的基础。
将标本直接与生理盐水混匀，制成湿片，加盖玻片后在显微镜下观察，如对于女性阴道分泌物，可用此法直接观察是否存在酵母菌或阴道滴虫。也可用10%KOH与标本混合，观察痰液、组织或皮肤刮片中的真菌。
标本或培养物可经染色后在镜下观察。革兰染色法已有100多年的历史，是实验室最常用的染色方法，通过革兰染色可将具有厚层肽聚糖的细菌染成蓝色，即革兰染色阳性细菌，包括球菌或杆菌，而具有薄层肽聚糖的细菌则被染成红色，为革兰阴性球菌或杆菌。进行革兰染色应注意染色反应的正确性，如涂片偏厚容易形成假阳性反应，过度脱色容易形成假阴性反应。当在镜下实在难以判定革兰染色性时，可对纯培养物用3%KOH做拉丝实验。通常拉丝实验阴性，为革兰阳性细菌；拉丝实验阳性，为革兰阴性细菌。
抗酸染色法，主要用于对具有分枝菌酸的分枝杆菌的检测。分枝菌酸与石炭酸复红形成复合物，不被3%盐酸乙醇脱色而呈红色，结核分枝杆菌抗酸染色阳性。诺卡菌、马红球菌，隐孢子菌等可表现弱抗酸性，但不能抵抗乙醇的作用，当用弱酸溶液代替3%盐酸乙醇，或3%盐酸乙醇脱色时间缩短，这些病原菌才能表现为抗酸染色阳性。
在镜下还可观察到呈单个细胞的酵母菌或多细胞的真菌。当同时观察到真菌菌丝及孢子时，说明真菌在体内进行繁殖。
在显微镜下是不能看到病毒体的，但可观察到有的病毒形成的包涵体。
将标本进行直接荧光抗体染色后可在荧光显微镜下观察，对于尚不能培养的病原体如卡氏肺孢子菌的检查具有重要应用意义。
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