结核分枝杆菌抗体检测

1882年，Robort Koch首次发现结核分枝杆菌为结核病的致病菌，1886年被Lenmann和Neumann正式命名为结核分枝杆菌（mycobecterium tuberculosis），简称结核杆菌，属于放线菌目分枝杆菌科分枝杆菌属。结核杆菌可侵犯全身各器官，但以肺结核最为多见。结核病至今仍为重要的传染病。对人类致病的有人型结核杆菌和牛型结核杆菌。人类对结核杆菌的感染相当普遍，全世界估计大约有1／3的人被感染过，但发生结核病者只是少数。近年来，由于AIDS的流行及耐药分枝杆菌的出现，结核杆菌的发病又有在全球流行加剧的趋势，现在全世界结核病患者2　000万，其中95%在发展中国家。我国结核病疫情也相当严重，全国1／3的人口已感染了结核菌，其中10%的人发生结核病。目前，流动人口的增加、耐药病人的产生、人类免疫缺陷病毒与结核菌的双重感染、结核病病死率不断的增加等，都是结核病控制工作面临的新问题。因此，控制结核杆菌的感染及蔓延是全世界范围面临的一个重大问题。

结核杆菌细长略弯曲，两端钝圆，大小为（1～4）μm×0．4μm，呈单个或分枝状排列，无鞭毛、无芽孢。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状、串球状、短棒状、长丝形等。涂片染色具有抗酸性，对苯酚复红具有独特亲和力，经染色，再用酸性乙醇冲洗无法使之脱色，故又称之为抗酸杆菌。

结核杆菌的抵抗力较强。尤其在干燥的环境抵抗力特别强，在干痰中可存活15年，结核杆菌在阴暗潮湿的环境中可以存活几个月，若黏附于尘埃上，保持传染性8～10d。结核杆菌对湿热敏感，在液体中加热62～63℃15min或煮沸即被杀死。在3% HCl或NaOH溶液中能耐受30min，因而常以酸碱中和处理严重污染的标本，杀死杂菌，提高检出率。但对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。在液体中加热62～63℃15min，直射日光下2～3h，75%酒精内数分钟即死亡。对酸碱有较强的抵抗力，易产生耐药性变异及L型细菌。

结核杆菌不产生内、外毒素。其致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。其致病物质与脂质、多糖和蛋白质等有关。结核菌可致肺部感染和肺外感染。

1．肺部感染　由于感染菌的毒力、数量、机体的免疫状态不同，肺结核可有以下两类表现。其一为原发感染，多发生于儿童。感染后约5%可发展为活动性肺结核，其中少数患者因免疫低下，可经血和淋巴系统播散至骨、关节、肾、脑膜及其他部位引起相应的结核病。90%以上的原发感染形成纤维化或钙化，不治而愈，但病灶内常仍有一定量的结核分枝杆菌长期潜伏，不但能刺激机体产生免疫，也可成为日后内源性感染的渊源。人类初次感染结核杆菌后有较高的免疫力，但不能预防再感染。其二为原发后感染，病灶亦以肺部为多见。由于机体已有特异性细胞免疫，因此原发后感染的特点是病灶多局限，一般不累及邻近的淋巴结，被纤维素包围的干酪样坏死灶可钙化而痊愈。若干酪样结节破溃，排入邻近支气管，则可形成空洞并释放大量结核分枝杆菌至痰中。

2．肺外感染　部分患者结核分枝杆菌可进入血液循环引起肺内或肺外播散，如脑结核、肾结核，痰菌被咽入消化道也可引起肠结核、结核性腹膜炎等。

结核菌最易感染的器官是肺。绝大多数由呼吸道入侵导致感染和发病。活动期肺结核的病人吐痰后，结核分枝杆菌就可随干了的痰迹飞散到四周，随时都可以感染健康人。因此，肺结核的感染率比其他器官高，占人体结核病的首位。结核病在全球的广泛流行，已成为重大的公共卫生问题和社会问题，是威胁人类健康的重要杀手。因此，及时地诊断和有效地治疗是防治结核病的有力措施。

近年来世界各地结核分枝杆菌的多耐菌株逐渐增多，甚至引起暴发流行，给结核菌感染的控制和治疗带来很大的困难。结核病的治疗在于控制疾病，促使病灶愈合，消除症状和防止复发。目前，常用的抗结核药物有异烟肼（INH）、吡嗪酰胺、链霉素、对氨水杨酸钠（PAS）、利福平、乙胺丁醇等。各种药物如联合应用，有协同作用，且能降低耐药性的产生，减少不良反应。

肺结核是一个流行较广的慢性传染病，处理必须以预防为主，预防结核病的传播必须抓好三个环节：控制传染源、切断传染途径、接种卡介苗。卡介苗确实已成为人类预防结核病的有效武器，特别是对儿童和青少年具有明显的保护作用。

对结核病的诊断，目前实验室常用的传统检测方法有涂片染色形态学检查、培养、动物实验等。事实证明，传统的镜检和培养的方法，远远不能满足临床的需要，如，涂片阳性率不超过40%，常规培养需要2～8周或更长的时间，另X线检查可靠性差，特别对肺外结核诊断更为困难。这些都严重地延误患者的治疗。快速诊断方法已成为迫切需要解决的问题。特别是POCT的检测，目前，免疫学检测、PCR扩增技术及基因芯片检测等已用于结核病的检测。PCR检测技术能够有效地分辨结核菌，具有快速、敏感性高、特异性强等特点。而胶体金法、斑点法等检测技术用于结核抗体的检测大大地缩短了检测的时间，为医院和防疫部门提供了快速有效的检测方法。

（一）斑点检测方法

【检测原理】　用结核杆菌胞膜蛋白作为包被抗原且进一步纯化，点样于硝酸纤维膜，运用间接法原理检测结核抗体。

【适应证】

1．活动性结核病诊断（肺内、肺外）。

2．涂片、培养阴性而有临床症状者的诊断。

3．肺癌等其他肺部疾病的鉴别诊断。

4．正常人体检。

5．获得性免疫缺陷综合征混合感染诊断。

【标本采集】　血清、胸腔积液、腹水、脑脊液等。

【参考范围】　阴性。

【操作方法】

1．封闭　加2滴封闭液于反应板，待完全渗入。

2．加样　加40μl新鲜血清标本，待完全渗入。

3．洗涤　加6滴洗涤液，待渗入。

4．加金　加2滴金标抗体，待完全渗入。

5．洗涤　加6滴洗涤液，待渗入。

【结果判读】

1．阳性　小孔中央有红色斑点。

2．阴性　小孔中央无红色斑点或仅痕迹。

（二）胶体金检测方法

【检测原理】　用间接固相免疫层析技术。当测试样本从样本孔向上迁移时，固定在膜上的结核抗原会与试验样本中的特异性抗体形成抗原-抗体复合物，再与标记有相应二抗的胶体金结合，形成肉眼可见的紫红色条带。质控线上的蛋白A也同时与金标二抗结合作为样本正确加入的标记。

【适应证】　同斑点法。

【标本采集】　血清、血浆、全血（肝素抗凝）。2～28℃不超过48h。

【参考范围】　阴性。

【操作方法】

1．打开密封袋，取出检测卡，编号。

2．在加样方孔①内加血清或血浆25μl（全血35μl连续追加1滴缓冲液）。

3．样本开始向上迁移，直至样本前沿到达蓝色指示线，在圆孔②内加3滴缓冲液。

4．拉出标有“TB”字样的塑料标签直至感到阻力，加入1滴缓冲液于加样方孔内，开始计时，15min时读结果。

【结果解释】

1．阴性　只有一条粉红色带（质控线）出现在孔的“C”区。没有结核分枝杆菌抗体或低于检测水平。

2．阳性　质控线（C）和测试线（T）皆显示粉红色条带。

3．无效　质控线（C）未显现条带。如出现此情况，需用新的卡片重新检测。

【临床意义】　由于涂片找抗酸杆菌的灵敏度低，结核分枝杆菌分离培养的周期长、难度大，分子生物学诊断开展少、假阳性率高，结核分枝杆菌抗体（IgG）可作为结核分枝杆菌感染的快速诊断方法之一，80%～90%的肺结核患者可为阳性。

检测血清结核抗体对肺结核的诊断和鉴别有重要价值。结核性脑膜炎、结核性胸膜炎、淋巴结核等肺外病状，临床表现可出现多变性和不典型性，同时检测血清与胸腔积液、腹水或脑脊液的结核抗体，两者同时阳性具有早期诊断价值。

【质量控制】

1．质控线含有一种蓝色染料，此线为检测前唯一可见的色条。如果C处的对照线未出现，则此结果无效。阳性样品会同时在T处看见有色条带。

2．可选择使用阳性与阴性对照。

【优缺点】　斑点法的敏感性为53．2%～68．8%，特异性为83．5%～100%，可检测血清、胸腔积液、腹水、脑脊液的结核抗体；胶体金法只能检测血清、血浆、全血中的结核抗体。

【局限性】　由于健康人群感染结核分枝杆菌较为常见，血清中可以出现一定滴度的结核分枝杆菌抗体，但并不一定发病，其检查结果应密切结合临床和其他检查进行诊断。