多发性骨髓瘤的分子机制

第二节　多发性骨髓瘤的分子机制

多发性骨髓瘤（MM）是一种起源于生发中心后B细胞并能够产生单克隆免疫球蛋白（M蛋白）的恶性增殖性疾病，目前仍不可治愈，约占造血系统肿瘤的10%。尽管确切的发病机制尚不清楚，但近10年来，随着荧光原位杂交技术（FISH）、比较基因组杂交（CGH）、光谱核型分析（SKY）、长距离聚合酶链反应（LD-PCR）等细胞遗传学和分子生物学技术的迅速发展，以及关于MM发病新模式的提出，使得人们对MM及其并发症发病机制的认识也有了进步。这些进展不仅对于揭示MM的生物学特性具有重大意义，而且为研究新的以生物学为基础的治疗方法提供了思路和方法。目前，靶向于MM细胞及其生长和生存的骨髓微环境的治疗，如沙利度胺及其衍生物lenalidomide和蛋白酶体抑制药硼替佐米已经揭开了MM治疗的新篇章，二磷酸盐药物和重组人EPO的应用也在一定程度上提高了患者的生存质量和预后。

一、骨髓瘤细胞来源

从早期B细胞分化成为浆细胞要经历3个B细胞特有的DNA重塑过程完成Ig基因的修饰，即VDJ重排、Ig体细胞突变和Ig类型转换，重组前体B细胞的Ig基因重排形成B细胞受体发生在骨髓，而抗原识别、选择、体细胞高频突变和类型转换重组发生在淋巴结的生发中心。大多数B细胞肿瘤（包括MM）涉及生发中心（GC）或生发中心后B细胞，这两类细胞在进行基因修饰时，可能会发生基因突变、双链DNA的断裂或Ig基因的缺失等。生发中心后B细胞可产生浆母细胞，后者在归巢至骨髓前已完成了体细胞高频突变、抗原选择和IgH转换，最终分化为长生存浆细胞。尽管浆细胞可以由生发中心前B细胞产生，但MM和非IgM型MGUS却均是生发中心后B细胞产生的，它们具有浆母细胞／长生存浆细胞的表型特征，并在骨髓中分布。MGUS和MM共有的一个重要特点是增殖率低下，在进展期前的MM中处于分裂周期的细胞不超过1%。在非IgM型MGUS和MM中似乎存在两类细胞，其中占很小部分的一类细胞具有肿瘤增殖能力，与浆母细胞或前体浆细胞表达一些相似的B细胞标记（CD19、CD20、CD45），但不表达浆细胞标记（CD138），对于其更精确的表型和定位尚有争议。但占大多数的一类肿瘤细胞并不具有增殖活力，它们表型与正常的终末分化的长生存骨髓浆细胞表型相似，表达CD138、CD38以及其他的免疫标记。尚不清楚第2类细胞是否保持转化为第一类细胞的能力。IgM型MM较少见，其B细胞是停滞在同种型转化前（转换前B细胞）。

二、MM的多步骤阶段式发展模式

大部分学者认为MM呈多步骤阶段式发展模式。克隆性浆细胞肿瘤必须扩增到约109个细胞以上时，产生的Ig才能被血清电泳检测出呈单克隆Ig。MGUS阶段，单克隆Ig在5～30g／L，骨髓中浆细胞不超过10%。正是在这个基础上，“不灭”的浆细胞克隆在骨髓微环境里逐渐累积，每年0．6%～3%的非IgM型MGUS进展为表达同样克隆Ig的MM。没有明确的基因或表型标志来区分MGUS和MM，所以也不可能预测某个MGUS患者是否会或是何时会进展为MM。同样也就不清楚在影响MGUS进展的因素中，原发或继发的MGUS肿瘤细胞内部改变与非肿瘤细胞的外在因素的变化各起的作用有多大。冒烟型MM骨髓中瘤细胞持续＞10%，但无溶骨性病变或其他MM的并发症，很可能快速进展为典型的MM。平台期（S）MM是髓内MM的一个稳定阶段，瘤细胞＞10%，无其他恶性肿瘤的并发症，对化疗敏感，处于静息阶段。最后，MM的进一步进展会伴有逐渐加重的并发症（溶骨损害、贫血、免疫缺陷和肾损害），在某些患者可发生髓外浸润或浆细胞白血病，瘤细胞独立于生长因子和骨髓微环境而生长，产生对传统化疗的耐药，使之更加具有侵袭性（图1-1）。该假说认为MM的发展经历了一系列的分子事件。

一般认为，有30%～50%的MM患者经历了长期无症状、静止的M蛋白存在状态，临床可能被诊断为MGUS或冒烟型MM。新近，一些作者通过前瞻性研究认为绝大多数MM患者在发病前数年内经历了意义未明单克隆免疫球蛋白血症（MGUS）状态，存在M蛋白和血清游离轻链比值的异常。Kyle等通过大样本长期的队列研究试验确定MGUS可影响一小部分＞50岁的老年人群，增加他们进展为MM和相关疾病如巨球蛋白血症和原发性淀粉样变性的风险，转化率为每年1%。MM的这种发展模式与许多上皮癌相似，因而通过了解MM的分子事件也可能为认识实体瘤提供借鉴。

三、MM遗传学异常

遗传学不稳定是MM的一个显著特点，表现为明显多变的染色体异常核型。传统的细胞遗传学方法只能发现MM中比较常见的染色体异常，如13号染色体的缺失和14q32的易位。近年来由于分子遗传学技术的发展，应用FISH、SKY以及CGH发现几乎所有的MM患者都有染色体异常，通常核型非常复杂，既有数量上又有结构上的异常。而结构异常导致的核型不稳定极有可能是作为一个非常重要的初始步骤参与MM发病过程。

就目前所知，MM是由多个特定遗传损伤形成的一个独特组合，这些损伤包括特定染色体的获得或缺失以及Ig相关的染色体易位。此外，关于染色体小片段的获得或缺失以及影响单个基因的原发性或继发性遗传改变也有报道。虽然MM发病机制有待于进一步的阐明，但基于对染色体获得或缺失、染色体易位、转录异常以及细胞周期蛋白D（cyclin D）基因特异性表达的整体了解，我们现在已经可以形成一个了解MM的发病模式或框架。MM的这种独特的遗传学模式与其他肿瘤不同，不管是血液的、间叶细胞的、上皮来源的，甚至与急性淋巴细胞白血病都显著不同。

图1-1　MM的不同阶段及相关事件发生的时间

最早的致瘤性改变发生在MGUS阶段，至少有两个以上的事件并置，均与13q缺失重叠。一般认为IgH重排发生在生发中心B细胞，其他的事件（虚线部分）何时发生尚不清楚。MGUS已经有明显的核型不稳定性，并随着疾病的进展进一步增多。N-或K-RAS可能是MGUS转化为MM的标志，也可能是病因，但在某些患者出现在MM的进展阶段。癌基因被激活后，骨髓瘤细胞依靠骨髓微环境中分泌的一些细胞因子生长。但随之发生的一些遗传学和分子学改变，如因继发的IgH易位导致的C-MYC功能失调、p18-等位基因的缺失、p15和p16甲基化以及p53的突变或缺失等，使MM细胞恶性程度不断增加，最后可以不依赖骨髓微环境而向髓外发展

染色体数目异常称为非整倍体核型，见于90%以上的MM患者。根据细胞的染色体条数可将它们分成亚二倍体、假二倍体、超二倍体（HD）和近四倍体四组。由于近四倍体多为假二倍体或亚二倍体的4N复制，所以又将这三者划归一组，合称非超二倍体（NHD）。对于MM来说首要的是区分超二倍体与非超二倍体。Smadja及同事根据之前的观察于1998年提出区分这两种MM病人的方法。前者表现出超二倍体染色体核型，染色体数从48～74，获得是几个奇数染色体（3，5，7，9，11，15，19，21）的不同组合。非超二倍体中最常见的是-8，-13，-14，-16，-17，-22。HD MM占MM患者的50%～60%，预后较好。这两种类型的区别同样存在于MGUS中，很少随疾病的进展恶化而改变。运用非负矩阵因子分解法（NMF）对aCGH数据进行无监督分析已经证实了在MM病人中这两类染色体异常的存在。

除了染色体的获得和缺失，MM还常同时伴有影响免疫球蛋白基因座特定的染色体易位，称之为原发易位，因为他们通常从疾病的初期就已存在。这些易位涉及到免疫球蛋白H（IgH）基因座（14q32．3），而较少涉及IgL基因座（2p12，kappa或者22q11，lambda）。不仅如此，这些易位将作用强的Ig增强子并置到各种基因之中从而使其表达失调。通常来说这两种重排方式看似相互排斥，但在5%的MGUS和25%的进展期MM病例中，会出现这两种重排同时存在的现象。在最常见的基因重排中，有两种易位重排方式会直接增加Cyclin的表达：1种是t（11；14）（q13；q32），此种易位在MM病人的发生率为15%～20%，它将导致Cyclin D1的过度表达；第2种是t（6；14）（p21；q32），存在于2%～3%的MM病例中，它会提高Cyclin D3的表达。另一种易位t（4；14）（p16．3；q32），它在MM病人中的发生率约为15%，会使Wolf-Hirschhorn综合征候选基因1〔WHSC1，也被称为多发性骨髓瘤决定域（MMSET）〕功能紊乱，它编码一种与组蛋白甲基化转移酶同源的蛋白质和受体酪氨酸激酶成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）基因。一部分t（4；14）病人发展成FGFR3的活性突变。最后，t（14；16）（q32；q23）易位使得5%～10%病人中癌基因MAF的功能紊乱，此癌基因是一种碱性亮氨酸拉链转录因子；而在2%～5%病例中，t（14；20）易位影响了这个家族的另一成员的功能，即MAFB。随后的研究发现这些原发易位和NHD之间发生了密切地相互作用。因此，有理由将MM患者划分为两大类：HD和NHD。在NHD类中可根据原发染色体易位的不同被进一步细分为CyclinD1／D3组、MMSET组、FGFR3组、MAF组和其他组。应该强调的是这种区分虽然实用，但过于简化，因为原易位也同样存在于HD组中，且出现概率约为10%。

近来对MM基因表达图谱广泛的调查研究对于以上分类提出更强有力的支持，并且对不同组的发病机制有了更深入了解。一项研究中，对414名患者进行的无导分层法可将其分成7组，其中5组相当于HD组和NHD组的3个亚组（MAF组，Cyclin D1组和Cyclin D3组）以及t（4；14）易位组。第6组可定义为低骨病（LB），相当于NHD组中的“其他类”中，此组未显示出标志性的遗传学损伤及较低的溶骨性病变发病率。最后，第7组的病人的特点是增殖相关基因的过度表达，通常定位于染色体1的长臂，因而总生存率和无事件生存率最低。但是，在第7组中的部分患者，并置的一系列的过度表达基因中，包括增殖相关基因、HD特征基因，或是原发易位组特征基因。这些发现表明存在原发损伤的患者在获得附加遗传损伤后（可能包括1q的获得或者1p的缺失），可发展成一个更具侵袭性的疾病阶段。

四、单克隆丙种球蛋白病与多发性骨髓瘤演变的分子基础

从MGUS发展到MM的机制尚未完全弄清。就基因遗传学角度看，这两种疾病异常相似，它们有相似的HD／NHD染色体核型和IgH／IgL染色体易位的发生率，同时都存在13号染色体的缺失，甚至在表达水平上，也是非常相似。多个研究组都未能找到可用来鉴别MGUS和MM的表达标志只存在于MM而不存在（或者低发生率）于MGUS的少数遗传学改变中，包括两个RAS家族成员（NRAS和KRAS），涉及密码子12，13，和61的突变，相对于40%～55%MM病人，仅5%的MGUS的病人表现出这些突变。这提示胞外信号调节激酶（MAPK）途径活化在MGUS发展到MM中起主要作用。此外，相较MGUS，t（4；14）似乎更常出现在MM中，但也有t（4；14）在二者中发生率相似的报道。

五、IgH易位

IgH易位是MM最常见的染色体核型结构改变。细胞遗传学方法可以检测到20%～40%的MM中存在14q32基因座上的IgH基因易位，但实际上这种易位几乎存在于所有的MM细胞系，IgH易位在疾病的不同阶段发生率有所变化：在MGUS和冒烟型MM患者中约有50%，髓内MM患者中则更加普遍，为55%～73%，在浆细胞白血病患者中约85%，而在人骨髓瘤细胞系则大于90%存在此易位。

Ig基因易位可以分为原发易位和继发易位。目前大多学者认为：原发易位是由于B细胞特异DNA修饰过程中发生错误所致，主要发生在类别转换期，少数在体细胞高频突变期，极少数发生于vDJ重排期，所以易位断裂点位于IgH转换区／J区内，或与之接近。多数IgH易位都属于原发易位。与此不同，继发易位不涉及B细胞特异DNA修饰过程，可不累及Ig基因位置，发生率较低，但核型较复杂，而且肿瘤细胞群中异质性较大。c-myc易位是典型的继发易位，位于8q24，很少发生在15%MGUS，但在MM发生率为15%，进展期为45%，骨髓瘤细胞株中发生率为90%。继发易位多为不平衡易位、复杂易位和插入等，可形成3体。与正常IgH发生同种型转换重组的生理过程不同，这种转换在剪接和重组DNA的过程中错误地把其他染色体（非免疫球蛋白）上的外来DNA序列插入到重组区内，因此也被称为非法转换重排。其结果是有可能把其他染色体上的重要的癌基因易位到der（14）上，与IgH基因座上的3增强子（Eα1和Eα2）并置，在IgH增强子的作用下癌基因被激活。目前已经有相当一部分参与易位的伙伴染色体被识别。与IgH易位的常见伙伴染色体有4p16．3（MMSET和FGFR3）、16q21（CCN D3）、11q13（CCN D3）、16q23（c-MAF）和20q11（MAFB）的激活。这5种伙伴染色体在MM中总发生率约40%，分别是4p16．3约15%，16q21约3%，11q13约15%，16q23约5%，20q11约2%。在MGUS中涉及4p16．3和16q23的IgH易位显著减少，提示这些易位可能与MGUS进展为MM有关。

多种易位上调不同的癌基因表达，使我们很难确定所有易位会合作用的共同途径。目前通过对疾病的分子及细胞遗传学异常、临床特点及基因表达谱等进行综合研究，发现几乎所有MM肿瘤与正常浆细胞相比都高表达一种Cyclin D基因：t（11；14）（q13；q32）易位直接导致Cyclin D1mRNA高表达（正常淋系细胞不表达Cyclin D1）；t14）（p21；q32）易位高表达Cyclin D3mRNA；t（4；14）（p16．3；q32）和t（14；16）（q32；q23）与Cyclin D2 mRNA高表达间接相关；还有约1／3的MM中不具有t（11；14）（q13；q32）易位，但仍存在Cyclin D1的异常表达（可能由肿瘤细胞和骨髓基质细胞的异常相互作用介导）。这提示Cyclin D的异常表达可能是Ig易位致病的共同途径。但有1．2%MM既不表达Cyclin D1，也无Cyclin D2和Cyclin D3表达异常，这类MM绝大多数为超二倍体。正常情况下Cyclin D1是一个有丝分裂和细胞周期之间的“调节子”，被激活后通过使RB基因磷酸化，促使骨髓瘤细胞逃逸细胞周期依赖因子的作用，促进骨髓瘤的发生。FGFR3是酪氨酸激酶受体家族成员，在正常的浆细胞上不表达，但是易位后可以过量表达。一些研究证明FGFR3可以刺激骨髓瘤细胞增殖、抑制其凋亡，而且过量表达FGFR3的小鼠骨髓瘤细胞系还表现出了对地塞米松的原发耐药。

上述IgH易位并非MM特异，有的也存在于MM的浆细胞中，其他的B淋巴细胞恶性疾病也可出现，甚至在个别的正常人也可检测到。因此，IgH易位可能是作为一个早期事件参与骨髓瘤的发生，另外还有一些遗传学改变则同MM疾病进展密切相关。

六、超二倍体MM

目前关于这组MM的癌变机制了解甚少。尽管Cyclin D1或D2在此亚组中明确的致病作用仍旧无人知晓，但经数据分析显示HD中普遍存在该类蛋白的过度表达。奇数染色体的获得表明基因数目异常会导致几种致癌途径的协同失调。经比较HD与NHD的基因表达谱显示在这组病人中，涉及蛋白质合成以及蛋白质分解代谢和转运产生缺陷的基因表达增加。

总体而言，与NHD MM相比较，这组表现出更好的预后。然而近来的研究已鉴定出HD存在着和NHD病人预后相当的亚组。例如，gNMF识别出一个HD亚组病人可通过失去染色体13或者获得1q而成为奇数染色体。此外，此组较少获得染色体11。此组病人表现出异常差的无事件存活率，并且相对于无1q＋或者13号染色体缺失的HD患者，他们总生存率更低。在最近的一篇报道中，利用FISH和表达芯片、非监督聚类分析法证实，在HD中存在两组：1组表现出染色体11的优先获得，第2组表现出染色体13的缺失和1q的获得。Zhan等认为，这组病人可能会从HD演变到更具侵袭性和更高增殖活性的疾病阶段。另一项研究鉴别出HD下的4个亚组，其中组1比较独特，它具有高增殖活性，较差的预后及染色体1q获得。尽管此亚组病人中的1q获得／扩增与预后有着相对明确的相关性，但HD中染色体13缺失的预后意义仍旧具有争议性。HD中的其他遗传损伤与此组的较差预后相关联，例如IgH易位，特别是涉及未知伙伴。这些附加的易位协同染色体单体，可能是引起肿瘤的发展的启动因素。

七、非超二倍体MM

利用FISH、表达芯片分析法、和最近的aCGH技术将MM患者分成几个不同的组，得到的结果与易位的存在、断裂点基因表达的紊乱以及Cyclin家族成员的TC分类法密切匹配。

最早从20世纪80年代开始，人们就认识到MM中存在染色体异常，但缺乏解释其致病相关性的相关假说或模型。此后，在20世纪90年代，一些研究开创性地鉴定出MM最常见的一些染色体易位，并进行了深入剖析。尤其重要的是，研究证实了小鼠浆细胞瘤的染色体易位对免疫球蛋白重链（IgH）转换区域的影响。随后Bergsagel及其同事证明相似机制同样存在于人类MM中。相对于其他血液病，B细胞肿瘤包括MM的一个特有的标志即是IgH易位，它不像其他的白血病和淋巴瘤那样形成融合基因，而是利用Ig调控元件与癌基因启动子并置从而诱发癌基因的表达紊乱。实际上，B细胞这种特有的基因转换重组和不同程度上体细胞高频突变是导致MM的易位的因素之一。此后不久，就识别出几个被染色体易位紊乱表达的癌基因。值得强调的是，除了FGFR3和MAF之外，被不同染色体易位紊乱的基因致癌作用还没有被实验证明。

（一）影响细胞周期蛋白的易位

1．Cyclin D1　1997年Vanndrager等描述了MM中1lql3的断裂点位于着丝粒端距bcl-1／MTC215kb或距CyclinD1基因330kb处，与IgH基因易位后处于IgH强启动子和增强子的控制下，导致基因产物Cyclin D1过度表达。研究发现MM的t（4；14）异常与Cyclin D1表达相关。Cyclin D1蛋白促进细胞由G1期进入S期，是B细胞增生的重要因子。Cook等使用免疫组化方法分析，证明Cyclin D1阳性的骨髓瘤患者具有更长的生存率（3年生存率，分别为73%和27%；P＝0．005）。

2．t（11；14）（q13；q32）和t（6；14）（p21；q32）

t（11；14）（q13；q32）可导致Cyclin D1基因的表达紊乱，该易位最常见，用常规技术和间期FISH分析MM的发生率15%～20%，生物素标志的FISH显示约32%。易位涉及Cyclin D1和Myeov。前者位于11ql3，分散在整个100～330 kb的Cyclin D1基因上，IgH断裂点位于JH区或S区，这与IgH发展过程中由体细胞突变或类别转换重排的调节一致。易位后Cyclin D1表达上调，与CDK4或CDK6结合，导致Rb基因磷酸化，促进细胞由G1期进入S期；释放转录因子使DNA复制，阻碍成熟，促进细胞向恶性转变；导致细胞黏附分子（CAM）表达下降。存在此易位的MM发展快，大都进入Ⅲ期，循环中有大量的浆细胞，对化疗不敏感，患者生存期短，预后差。因此，有人认为Cyehn D1的过度表达是预后不良的一个指标。

t（6；14）（p21；q32）引起2%～3%MM病人中的Cyclin D3的失调。该易位较少，间期FISH分析MGUS占5%。6p21断裂点在CyclinD着丝粒端约65kh处，IgH断裂点在CH区，包括S和位于JH下游与S上游之间的内含增强子及3增强子序列：易位后使CyclinD3表达上调，Cyclin D3在调节细胞分裂方面的作用及机制同Cyclin D1蛋白。

在最近的一项研究中，Zhan等显示了Cyclin D1和D3在肿瘤中是如何簇聚在一起的。同时存在Cyclin D1和D3易位的病人中，均存在代表t（11；14）和t（6；14）易位。这两组在临床参数或者存活率上没有明显区别，但在致病性和临床意义上的差别尚未知缘由。总之，相对于有着t（4；14），t（14；16），和t（14；20）的NHD病人，含有Cyclin D易位的病人往往有更好的预后。这些易位的致病后果仍不清楚。

（二）t（4；14）和成纤维细胞生长因子受体3和MMSET

另一种易位，t（4；14），出现在约15%的病人中，这种易位源于IgH转换重组的错误。从而导致增强子5＇Eμ和3＇Eα分离并紊乱表达衍生染色体［der（4）和der（14）］上的基因并置。在der（14）上，3＇Eα增强子紊乱表达酪氨酸激酶FGFR3基因。在der（4）上，5＇Em增强子驱使WHSC1（也叫做MMSET）基因的表达，此基因编码一种与组蛋白甲基化转移酶同源的蛋白质。MMSET／WHSC1长120kb，5端非转录区位于FGFR3近50kh内，断裂点在MMSET／WHSC1上。MMSET是三胸苷核蛋白成员之一，包括MLL，PHD（锌指）和SET区域。MLL参与基因表达“后生说”调节，SET参与纤维母细胞转变。该基因主要在转录时提前终止或剪接后缺乏氨基末端，在MM发展中起重要转录调节作用，但MMSET／WHSC1同临床病理特点的关系尚不清。约10%含有t（4；14）的病人同时激活FGFR3的突变。尽管存在t（4；14）易位的病人中，MMSET几乎都是上调的，但是多达25%的病人并不过度表达FGFR3基因，这就表明t（4；14）病人的主要致瘤作用是由MMSET而不是FGFR3来完成。另一方面，若干临床前研究也证实FGFR3的活化型［存在于少于10%的t（4；14）病人中］有潜在的致癌性。许多研究也一致证明了多数使FGFR3功能活化的突变具有潜在的致癌性。依赖于配体激活白细胞介素-6（IL-6）的鼠B9细胞在缺乏IL-6的情况下表达增殖野生型FGFR3，但是在没有FGF或IL-6的状态下，用突变FGFR3转染B9细胞后仍可独立生长。大部分突变型FGFR3（而非野生型FGFR3）能够诱导裸鼠在转染NIH3T3细胞后形成病灶和肿瘤。注射骨髓造血细胞的照射小鼠感染到FGFR3突变后会在6周内发展成可移植性肿瘤，而野生型FGFR3只会在1年后诱导出现肿瘤。特异的FGFR3抑制药会减少肿瘤增殖并增加含有活化FGFR3的t（4；14）MM细胞株和t（4；14）病人的细胞凋亡率。因此，在没有活化FGFR3的情况下，运用FGFR3抑制药来治疗t（4；14）患者有效性有待进一步确定。

目前为止，仍没有有力的证据来确认MMSET在MM发病机制中的作用。但比较明确的是，MMSET可影响癌症的发生并很可能参与致癌途径。例如，螺旋-环-螺旋转录因子分化抑制药1（ID-1）被证明是MMSET的作用靶标，不同MMSET的异构体与HDAC1和Sin3b相互作用。MMSET的两个同源染色体与肿瘤联系紧密。尤其是WHSC1L1参与急性骨髓性白血病的一个染色体易位t（8；11）（p11．2；p15），且它在乳癌和肺癌被扩增，具有致癌活性。此外，另一个MMSET同系物，NSD1，也与急性骨髓性白血病相牵连。

若干研究表明t（4；14）与不良预后明显相关。

（三）MAF和MAFB易位

t（14；16）（q32．3；q23）出现在5%～10%MM患者中，并诱导癌基因c-MAF的过度表达，而据报道（14；20）（q32；q11）占MM的2%～5%且影响MAFB同系物。这两种易位有着相似的表达标记，这表明它们有着共同的作用靶标。但奇怪的是，在没有易位的情况下，也曾有报道c-MAF的过度表达，其机制不清。c-MAF的致癌作用已被明确证实。c-MAF的强制性过表达可提高骨髓瘤增殖能力，这可能是通过它的一个目标基因-Cyclin D2起作用，因为在这些患者中一致存在Cyclin D2的过表达。c-MAF抑制阻断免疫缺陷鼠的肿瘤形成。另一个c-MAF靶标--整合素b7，可增加骨髓瘤对骨髓基质的黏附并提高VEGF的产量。因此，似乎是c-MAF能刺激细胞周期的成长并改变骨髓与基质的相互作用。另一篇报道中提出ARK5［一种调解Akt信号的AMP活化蛋白激酶（AMPK）的相关蛋白激酶］是c-MAF和MAFB信号的靶标。之前的报道表明此组患者中骨病的发生率较低。近来的文献指出可能涉及2个基因导致了以上结果。其中DKK1基因在这组病人中明显下调，该基因在MM相关骨病中过度表达。此外，近来Robbiani及其同事报道基因骨桥蛋白（OPN）与MM骨病逆相关，并在携有影响MAF基因的易位患者中特定过度表达。

尽管不像t（4；14）病例那么明显，但是影响MAF的易位也与不良预后相关。

八、附加的遗传学损伤

aCGH研究已经证实在骨髓瘤细胞系和MM肿瘤局部病灶的有周期性强振幅拷贝数畸变。例如在近期的一个研究中，基于在原肿瘤中出现并发生至少1个强振幅波的事件，辨别出87个最小共同区（MCRs）：47个扩增和40个缺失，跨距0．89Mb大小的中值包括平均12个已知基因。在这些损伤中，包括了已知致病相关性的MCRs，如TP53肿瘤抑制因子的区缺失，肝细胞生长因子（HGF）基因、MYC和ABL1癌基因的病灶扩增区。相似的分析也在缺失基因座中被尝试了，但是根据TP53的表现显示半合子的缺失会使过度表达不稳定。对扩增的MCRs而言，继c-MYC行为后患者不论有无扩增，过度表达都会出现，此结果是与健康捐献者浆细胞的表达水平相比较而得到的。这也证明它的表达失调是由基因数量变化外的机制来调节的。因而对于扩增的MCRs里的每个基因，只有那些不论有无扩增的存在都能够过度表达的基因（Affymetrix探针）才能在筛选中幸存。在MM生长中，这种“类癌基因表达模式”的基因被认为是最有可能在MCRs里成为扩增靶标。按这种标准，2　151个位于扩增MCRs的Affymetrix探针中仅有约30%可以在筛选中幸存，包括那些在MM发病机制中已经被确定作用的基因，像MYC，MCL1，IL6R，HGF，和ABL1，以及许多与MM生长尚未知有联系的但却有着多样化功能的基因。需要更严格的验证工作去证明那些从aCGH研究中获得的候选基因是否存在潜在致癌性及其相关性。

九、其他存在于多发性骨髓瘤中的遗传学损伤

HD和NHD，连同特定染色体易位都与预后相关。一些仅影响单个基因的其他染色体畸变和损伤已经被报道与不良预后有关。此外，一些损伤（特别是在1q获得／扩增）引起增殖活性的增加，这是在所有癌症中早已被认知的模式。依照近期Zhan等的研究表明，在MM中，患者是以不同易位为特征，HD组患者也可能发展成一种以高增殖活性且不良预后相关基因表达为特征的模式。应当强调的是，任何预后标记都应该考虑到它对治疗方案的极大依赖性。大多数评估遗传损伤的预后相关性研究都包含有大剂量化疗的患者，最终会与骨髓移植相关。近来的一项针对用硼替佐米治疗的患者的研究表明，几个最被公认的遗传学预后标志没有显示出患者用药后有任何预后相关性。

（一）1q获得／扩增

在1号染色体的长臂上获得／扩增已经被许多研究所证实，发生率为30%～40%。跳跃易位可能与高度去浓缩中心体周围的异染色质有关，据认为是导致这种畸变的潜在机制。1q上的获得／扩增与t（4；14），t（14；16）相关联，并有可能与染色体13的缺失相关，它还与其他增殖性疾病有关。依据细胞遗传学分析、FISH、表达图谱和aCGH的结果，一些研究提出这个区域异常与较差预后有关。重要的是，Shaughnessy等指出在1份与疾病相关的早期死亡相关的70个基因中，染色体1q上存在过度表达现象。但其他的研究却质疑此区域的预后相关性。1q的获得／扩增已经与HD中有不良预后的子组相关联（见前面的分析）。

据报道，蛋白激酶CKS1B是位于此区域的一个基因，它可能作为扩增靶标。尚无研究表明存在选择性靶定此基因扩增或易位的位点；在1q21上的区域扩增通常比较宽泛，跨越好几个巨碱基。另一方面，基于CKS1B过度表达的功能获得性研究和shRNA功能丧失性研究建议，CKS1B的功能之一是作为在1q-MM病例中的最有希望扩增靶之一。

（二）染色体13缺失

Tricot等首先强调了MM中染色体13缺失（Δ13）的高发生率以及其预后潜在作用。随后的研究证实Δ13s是最常见的半合子，在超过80%～85%的患者中它倾向于影响整个染色体13。近年来Δ13因为同MM患者预后密切相关而受到很大的关注。Δ13包括13单体（占90%）和13q-，是MM最常见的染色体异常，Δ13s在MGUS和MM里有着相似的发生率，约50%。此外，Δ13与其他遗传损伤有个强烈的相关性，包括t（4；14），t（14；16），NHD，和以差预后的1q为特征的HD子组（尽管不是所有的1q病例得都有Δ13，反之亦然）。在少于10%患者中，病灶都发生在与13q14相对应得区域，那儿是肿瘤抑制基因RB1所在地。有趣得是，Carrasco及其同事的aCGH研究显示，在所有的原肿瘤及细胞株中，没有病灶基因MCRs出现在此区域。在对两个HD组（即好预后HD和预后差的HD，以1q获得与染色体13缺失为特征）上的整体染色体13的基因的表达水平进行的比较研究中突出的对应到13q14的一个区域，与没有这些损伤的HD相比，13q14区域显著的强化了HD中1q和13号染色体缺失的下调基因。

这些发现提示在Δ13患者中，此特定区域上的基因表达优先沉默，但其机制尚不清楚。尽管RB1属于此区，但它并不包括在那些下调基因中。RB1在MM中作用被质疑了很久，因为此基因的失活突变在染色体13的半合子缺失患者中未被鉴定到。或者根据单倍剂量不足原理，此区的候选肿瘤抑制基因就是RB1，抑或是有其他基因参与其中。TRIM13（别名RFP2）属于潜在候选基因，在慢性淋巴性白血病中染色体13缺失的病例里，它被提出是隐蔽性肿瘤抑制基因。TRIM13（而不是RB1）被Elnenaei及其同事在Δ13MM患者上发现位于MCR边界，它同时也是在HD有Δ13对没有Δ13的aCGH研究中，被列入显著下调基因。此外TRIM13也是唯一位于染色体13且被列入前面Shaughnessy等早期研究的70个基因之一。

若干研究提出将Δ13作为独立差预后因子。但是近期的研究结论性地证实Δ13是亚二倍体的替代，而不是独立差预后因子。原因可能是由于细胞遗传学检出的Δ13克隆中还包括了那些具有高增殖性的MM细胞克隆。

（三）与存活率低相关的最小共同区

aCGH分析确认MCRs与存活率低相关下文称之为PS-MCRs）见表1-1。表中列出染色体8上的扩增（包括MYC）、1q上扩增和ch17上的缺失（包含TP53）等先前提到的在MM中与差预后相关的遗传事件。剩下的扩增PS-MCRs中，2个位于新MM基因座。第一个新扩增PS-MCR定义了一个跨越6Mb有着37个基因的ch8q24区（与MYC不同），且它在其他人类癌症中以差临床结果和肿瘤复发而著称。第2个新扩增PSMCR靶定一个ch20q区域（43个基因），它在前列腺癌、食管鳞状细胞癌、胃腺癌、和直肠腺癌中与疾病恶化和转移有关。在10个缺失的PSMCRs中，4个分散区根据FISH结果以及之前的研究暗示它们在MM患者中有着差预后。剩下的PS-MCRs缺失包括3在ch16上，2个在ch17上（1个藏身于TP53）和2个在ch20上。其中，16q12区（45个基因）包括肿瘤抑制基因CYLD，此基因是NF-kB途径的关键同是在MM里越来越显得重要。这些损伤的预后相关性需要在有足够样品数的前瞻性研究中被验证，但是它们为基因发现和潜在重要临床相关性的鉴定提供了有价值的入口点。

表1-1　与预后相关的最小染色体共同区

（四）TP53缺失和突变

p53基因位于17p13，由于都是小的间歇性缺失，因此常规的细胞遗传学很难检测到。MM中TP53肿瘤抑制基因的突变发生率介于2%～20%。据报道，TP53突变在MGUS中有着低的发生率，在MGUS的浆细胞中没有检测到这一缺失。但会随着病情的恶化而升高，初诊MM患者p53异常的很少，但在复发MM和浆细胞白血病的患者比例逐渐增多。在MM细胞株中可高达80%。Chng及其同事表明TP53突变与差预后高度相关。不仅如此，在同一项研究中，TP53突变在t（4；14）和t（14；16）患者中有着显著的较高发生率，但尚未报道它与HD和Δ13相关。最后，尽管因为只有很少的突变案例，我们应该谨慎的对待研究结果，但是当这些易位病人附加还有TP53突变的时候表现出更坏的预后。

其他的研究利用17p13缺失（大部分是半合子）作为TP53途径失活的替代，据报道，它在大多数病例中的发生率约为10%并与差预后有很强的相关性。Chng及其同事报道到50%有TP53突变的MM患者都伴有17p13半合子缺失，相反地，仅有16%的17p13半合子缺失患者会在TP53的剩余拷贝上发生突变。因此，现在仍旧不清楚当在剩余TP53拷贝中未探测到突变时，TP53路径是否在半合子17p13缺失MM病例中沉默。此外，17p13缺失是否真的是TP53的替代或者与别的未明肿瘤抑制途径相关，这些都尚未弄明白。

（五）RAS突变

属于Ras家族的两个基因（NRAS和KRAS）在MM患者上比在MGUS患者上有着更高的发生率。RAS突变与Cyclin D1表达水平的增高相关，但却与t（4；14）无关。

N-RAS和K-RAS点突变（第12、13和61位密码子）的激活在MGUS、孤立性浆细胞瘤和惰性多发性骨髓瘤细胞中非常罕见，但可见于10%～40%的初诊MM患者，并且随着疾病的进展检出频率更高。早期的研究可能没有充分估计到RAS突变的频率。最近一项使用敏感的PCR限制性片段长度多态性分析表明所检测到的34例标本中均有N-RAS基因的第61位密码子突变。合并RAS基因突变的初诊患者占55%，复发患者占81%，因此RAS基因突变可能在MM的发病进展中起重要作用。

（六）MYC改变

MM中c-MYC的异常表达许多年前就被认识，并与病情的恶化强烈相关。传统的染色体核型分析很难检测到位于8q24染色体上的C-MYC基因异常。Loiseau等用FISH法检测140例MM也只发现3例有t（8；14）（q24，q32），然而Shou等用多色FISH法检测38个进展期MM患者发现40%患者有c-MYC易位。与Burkitts淋巴瘤不同的是，c-MYC是在非Ig序列区重排，而淋巴瘤是在Ig基因区重排；c-MYC重排是淋巴瘤发生中的一个原发分子事件，而在MM发病过程中则是作为一个晚期事件或是2次事件发生。直到最近，人们才发现掩藏在表现为c-MYC过度表达的MM背后的重排模式。25%的重排是将c-MYC与IgH或IgL基因座并置，此模式远比原位易位中经典的相互易位要复杂的多。扩增、缺失、倒位、和无明显易位的插入、或者不含Ig基因座的易位都在案例中被发现。在一个大样本的研究中，涉及c-MYC的重排在MGUS的发生率为3%，而在MM中为10%～16%。现有的关于浆细胞白血病（PCLs）的数据各个研究之间相互不一致，Fabris等表明4个PCL患者就有3个c-MYC重排，而Avet-Loiseau等只在23个患者中发现3例MYC畸变。相反，MM细胞株有着更高的c-MYC基因座重排率，不同的研究中其重排率可从55%波动到超过90%。尚无报道显示原位易位与染色体13缺失之间有关联，但却注意到MYC重排与β2微球蛋白水平直接相关性，这就暗示c-MYC重排对预后有潜在影响。近来的aCGH调查显示包括c-MYC在内的MCR属于PS-MCR。

c-MYC癌基因是肿瘤生长演进的调节器，其行为受生长因子家族蛋白调节，在美法仑耐药的MM患者中存在c-MYC蛋白过度表达的现象，c-MYC的失调导致了血小板衍生生长因子-β（PDGF-β）受体分子表达，并减少了PDGF-BB（含两个B链的同型二聚体PDGF）的释放。

（七）P18与RB1途径的其他成员

据报道，除Cyclin D失调外，RB1途径的其他成员发生了改变，但是这些改变的致病与临床相关性却没有被完全阐明。例如，肿瘤抑制基因CDKN2A（p16）通常在MM中不缺失，但往往在MGUS和MM中被甲基化（20%～30%）。此种表型与最常见的遗传损伤或者预后没有发现明显的关联，但有2份研究例外，这2项研究证明其与增生型疾病相关。另一方面，CDKN4C，p18在MM中的作用被公认。p18在缺乏p18的MM细胞株中的过度表达可降低增殖活性，但在p18正常表达的细胞株中却没有影响。p18纯合子地被删除，在MM细胞株中高达38%而在MM肿瘤中仅2%，但此百分比在增殖程度高的肿瘤中可升至10%。p18经常在高增殖的MM中过度表达。

在对MM的回顾性研究中，发现有13号染色体的缺失现象，并提示预后不良。这一缺失与Rb-1基因突变有关，它是一种抑癌基因，但是只有磷酸化的Rb-1蛋白才有抑癌活性，可下调IL-6的表达，但据称Rb-1灭活只在骨髓瘤晚期才出现，并非始动因子。Rb-1基因失活或表达减少可能与MM的发病有关。Rb蛋白阴性是影响化疗疗效的独立负性因素，预示着该MM患者难治。

Requena在对40例累及皮肤MM患者临床病理、免疫组化和细胞遗传学研究时发现：皮损处的瘤浆细胞表达CD79a、CD138以及EMA强阳性，CD38及CD43表达较弱，但持续阳性；使用FISH检测皮损处真皮内浸润的瘤浆细胞发现，其Rb-1基因表达缺失。在对这些患者进行Ig-GH基因重排的PCR检测时发现40例中22例有JH基因的单克隆重排。尽管给予了冲击性化疗，但所有病人在皮损出现后几个月内均死亡。由此推断无论治疗方案如何，MM患者一旦出现皮肤浸润，预后极差。并认为检测Rb-1基因可能是一个鉴定特别侵袭形式MM的预后标志物。

（八）DNA甲基化

通过DNA甲基化对基因表达进行修饰是后天发生的重要遗传学改变。在60%～75%的MM中可以发现一些蛋白包括死亡相关蛋白激酶（DAPK）、SOCS1和细胞周期调节蛋白P15、P16等被甲基化而失活。DAPK参与调节IFNλ诱导的凋亡；SOCS1蛋白参与JAK／STAT信号途径，通过抑制包括IL-6、IL-4、LIF、IFN等细胞因子的信号表达在正常的淋巴细胞发育和分化过程中起重要的作用；细胞周期调节蛋白P15、P16通过使PB蛋白的去磷酸化导致细胞G1期阻滞。这些基因被甲基化可能在MM的发病早期起作用，而在MGUS向MM的转化中不具有显著作用。

十、骨髓微环境的作用

正常的浆细胞及所有的髓内阶段的骨髓瘤细胞都要依赖骨髓微环境生长、发育和分化，因此骨髓微环境在MM发病中具有非常重要的作用。骨髓微环境包括细胞间质蛋白和骨髓基质细胞等成分。瘤细胞和基质蛋白如纤维结合素、vitronectin、laminin和胶原等结合后通过抑制caspase8的激活和Fas诱导的凋亡、上调p27kipl的表达、G1期阻滞等途径保护骨髓瘤细胞免受化学药物诱导的凋亡。最初由MM细胞上的黏附分子如整合素、免疫球蛋白超家族、钙调蛋白、选择素等介导瘤细胞与骨髓基质蛋白或基质细胞的结合，MM细胞一旦与基质细胞黏附，则可以诱导一些细胞因子包括IL-6、胰岛素样生长因子1（IGF1）、TNFα、VEGF、SDF-1等的转录和分泌，这些因子反过来又可以进一步促进瘤细胞对骨髓基质细胞的黏附。这些因子在促进瘤细胞的增殖、生长、耐药和迁移中发挥重要作用。

（一）IL-6

IL-6无论在体内还是体外均是骨髓瘤细胞的关键性生长因子。属细胞因子超家族成员，是骨髓瘤细胞最主要的生长、发育因子。IL-6主要骨髓基质细胞产生，骨髓瘤细胞黏附于骨髓基质细胞后通过分泌TGFβ等细胞因子将进一步促进基质细胞转录和分泌IL-6．IL-6在骨髓瘤的作用主要包括以下几个方面：通过Ras／Raf／MEX／MAKP途径促进骨髓瘤细胞增殖；通过P13K／AKT信号途径包括保护瘤细胞免受地塞米松等药物诱导的凋亡；增加VEGF的表达；阻止单核细胞向树突细胞（DC）的分化从而阻抑DC的抗原递呈功能；通过JAK／STAT信号转导途径上调BCL-XL、MCL1、C-MYC等基因的表达，诱导瘤细胞增殖、抑制凋亡。MCL1是MM一种重要的生长因子。通过反义寡核苷酸技术阻断MCL1的表达后可以迅速诱导MM细胞凋亡，而且不被IL-6所拮抗。

（二）TNF-α和干扰素

由MM细胞和骨髓基质细胞分泌，主要作用是激活NF-κB，上调MM细胞上的黏附分子LFA、VLA4和它们在骨髓瘤基质细胞上的配体ICAM1、VCAM1的表达，从而促进骨髓瘤细胞对骨髓基质细胞的黏附，刺激MM细胞生长、免于凋亡。

我们以及国外学者的研究表明，γ干扰素可抑制骨髓瘤细胞系和新鲜分离的骨髓瘤细胞的增殖。γ干扰素调控骨髓瘤细胞增殖不是通过影响IL-6的分泌，而是通过下调骨髓瘤细胞表面IL-6受体α以及IL-6受体复合物的表达来实现的。

十一、总　结

过去10年里，人们已经逐渐阐释了MM中早期事件的概要，但尚未弄清此病发病机制的几个极其重要问题。例如，我们对MM发病中一些主要事件的作用知之甚少，包括Cyclin D的过度表达和MMSET在发病早期的活动。我们才刚刚着手研究促进MGUS进展到MM的附加损伤以及MM如何进展到更具侵袭性和增殖性的疾病阶段。骨髓基质和MM浆细胞之间的异常关系也还没有被完全探明。最后，对于MM肿瘤干细胞生物学的了解以及对启动和维持骨髓瘤细胞增殖和分化的途径的认识仍处于初始阶段。有可能的是，出现在急性白血病中的模式，即遗传事件的有序演化和肿瘤干细胞的增殖和分化的紊乱，同样也出现在MM中，从而为我们解决这个致命疾病提供了一个更有效的治疗思路。

（蓝海峰　侯　健）