多发性骨髓瘤微小残留病检测

虽然多发性骨髓瘤（MM）目前仍被认为是不可治愈的疾病，但前景已经发生了变化，随着新的制病机制的发现，针对新的治疗靶点而设计的药物已经在临床进行试用。另外大剂量化疗联合应用自体造血干细胞移植和（或）异体造血干细胞移植，使得部分患者获得了完全缓解，但这些患者多数会出现复发。经典的评价治疗反应的方法是根据蛋白电泳（EF），目前的标准是血清免疫球蛋白免疫固定电泳（IF）阴性虽然IF比EF敏感，但如果出现寡克隆条带则结果难以解释，并且可能造成假阳性。2006年出台的国际统一MM反应标准已经将血清游离轻链（FLC）列入寡分泌型或非分泌型MM患者的反应标准中。目前已经明确的是治疗后的反应水平影响病人的预后，如果患者获得CR，尤其是大剂量化疗后获得CR将有较长的生存。而获得CR后复发的主要原因之一是存在微量残留病（MRD）。然而目前确定CR的标准难以判断MRD的水平，因此需要采用敏感的方法进行检测。MRD检测的主要采用2种方法：聚核酶链反应（PCR）和多参数流式细胞术（MCM）。下面分这两部分进行介绍。

一、PCR在MM MRD检测中的应用及意义

MM是1种克隆性B细胞疾病，以恶性浆细胞在骨髓内累积并产生溶骨性病变和大量的单克隆蛋白为特征。B细胞性克隆性疾病最常见的基因标志是免疫球蛋白重链（IgH）基因的克隆性重排。人类免疫球蛋白重链基因包括39～51个功能性可变区（VH），27个多变区（DH）和6个结合区（JH）。在正常B细胞分化早期，在Pro-B到Pre-B分化阶段，DH片段与1个JH进行结合产生不完全的DJH重排，然后VH片段与DJH结合产生完全的VDJH重排。在VDJH重排时，在结合区出现插入、缺失或复制不同数量的核苷酸提供产生众多不同IgH基因的潜能。在IgH完成重排后，Ig的轻链位点开始重排，首先起始Kappa位点重排，如果不能产生1个功能性的IGK重排，Ig lambda（IGL）位点则开始重排。通常情况下，IGL的重排总是伴随着删除1个没有功能的IGK重排。

在B细胞表面组装1个功能性的IgH-IgL复合物，即所谓的B细胞受体（BCR），使得B细胞能够逃避凋亡并进行成熟过程。不成熟的表达表面Ig的B细胞离开骨髓进入次级淋巴器官。在淋巴结B细胞穿过套区进入生发中心。在生发中心当与同源抗原接触后，B细胞进行亲和成熟。在此阶段出现2个重要的基因事件，即体细胞高度突变（somatic herpermutation SHM）和类别开关重组（class switch recombination CSR）。SHM在重排的Ig基因中引入点突变，使得生产高亲和力的抗体，这些抗体能够识别并与抗原进行最适的结合。在起始与抗原接触后，便产生低亲和性的IgM，CSR就是产生具有不同功能特性的特异的IgG、IgA、IgE同源型的机制。在生发中心的反应中，B细胞与外源抗原反应被阳性选择后分化为浆细胞和记忆性B细胞，那些与自身抗原反应的B细胞则通过凋亡被去除。VDJ基因重排与不同的V基因突变是每个B细胞及其子代细胞所特有的，是1个理想的克隆性标志。

由于B细胞在其成熟过程中经历了多步骤的IgH基因重排，使得浆细胞能够针对每一种抗原产生特异的抗体。由于IgH基因重排的多变性，使得每1位MM患者所具有的IgH基因重排均是不同的。因此在检测IgH基因重排时，最特异和敏感的方法是针对每1位MM患者发病时具有的单克隆的IgH基因进行检测，这样就需要首先对单克隆的IgH基因进行测序，然后根据每一位患者特异的IgH基因序列设计特异性的引物和探针进行PCR检测，即等位基因特异性PCR（ASO IgH PCR）。这种方法的灵敏度可以达到10-6～10-5，因此是非常敏感的，但缺点是需要患者发病时的标本，需要进行测序分析并合成个性化的引物和探针。因此较复杂，耗时，费用高，难以进行临床常规检测。针对此问题，人们根据IgH基因的保守区设计引物进行PCR扩增，即通用引物（consensus）IgH PCR。该方法的优点是不需要进行测序分析，多数患者在发病时可以检测到单克隆或寡克隆性的条带。缺点是扩增的敏感性不高，在治疗后体内恢复正常Ig的生产时，会同时扩增正常多克隆Ig和异常的Ig，在扩增后进行电泳时则产生多条弥漫性扩增带，因此难以判定哪条带是特异性的，即难以判断阳性和阴性，使该方法的敏感度一般在10-3左右。文献报道即使采用筑巢式PCR方法也只有标本中PC＞10%时才能扩增到IgH重排。针对此问题，在反向引物上标记荧光，PCR后利用仪器分析扩增片段的长度和荧光强度来确定是否为阳性，该方法既荧光PCR（F-PCR）。由于F-PCR可以分辨3个碱基差别，使该方法将灵敏度提高到1%水平，可见此种PCR不够灵敏。

由于体细胞高度突变和缺失突变造成引物结合区的改变，使引物不能退火，部分患者即使采用通用引物也不能扩增到克隆的条带，VDJH完全重排的IgH PCR的阳性率在17%～80%。针对此问题Gonzalez在2005年介绍了一种以不完全DJH重排作为扩增的模板，约60%MM患者具有不完全DJH重排且90%不包含体细胞高度突变。2008年Mart1nez-Sanchez同时检测了不完全DJH重排和轻链重排，使PCR的阳性率达到91%。下面就不同方法和意义进行介绍。

（一）定性PCR

1．通用引物IgH PCR　1993年Bird利用IgH PCR检测5例异基因移植后长期存活（9～60个月）MM患者MRD，5例患者在移植后1年内全部是PCR阳性，但3例随访＞1年的患者分别在移植后1年、2年和4．5年PCR变为阴性。作者认为早期PCR阳性是普遍现象，并不能预示复发。

国内黄红铭回顾分析41例经治疗后达到非常好的部分缓解（VGPR）或以上疗效的MM患者外周血的PCR的结果，包括自体外周血干细胞移植（ASCT）患者21例和未移植患者20例。观察患者确诊时的IgH阳性率、达到上述疗效时的转阴率，以及2组患者的复发率和持续缓解时间（DOR）的差异。结果：35例患者IgH克隆性重排阳性（85．4%），经化疗后达疗效时IgH转阴率为25．6%。移植组未转阴者复发率为7／12，DOR为22．5个月，转阴者复发率为1／5，DOR为42．5个月。未移植组未转阴者复发率为7／13，DOR为22个月，未移植组转阴者复发率为1／5， DOR为21个月。说明PCR阳性与阴性患者之间复发率明显不同。但该组病例中非移植组PCR转阴者比例较高，除去可能与化疗强度有关外，不能除外因采用通用引物PCR，灵敏度较低而出现较高比例的PCR阴性结果。

利用F-PCR方法Galimbertia和Mart1nez-Sanchez对MM患者移植后的MRD进行了研究。2005年Galimbertia报道了20例MM患者接受自体PBSCT和非清髓异基因移植（NMT）后分子检测MRD的意义，结果所有的患者均完成了治疗，治疗相关病死率是20%，2年无进展生存率是51%，说明这种治疗是可行的。在PBSCT后只有3位患者（15%）获得了PCR阴性，但在NMT后12例（60%）获得了PCR阴性。76% PCR阴性患者在20个月时存活而PCR阳性组中只有34%存活。此组病例中嵌合状态似乎与MRD无显著相关，有54%为完全供者的病人PCR阳性，而65%混合状态的病人PCR阴性。这篇文章说明NMT使较高比例患者获得分子缓解，对自体移植后处于稳定期的患者NMT有益。

2008年Mart1nez-Sanchez检测了88例MM患者诊断时和53例患者治疗后不完全的DJH重排、Kappa轻链K-VL重排和Kappa缺失原件及lambda轻链L-VL重排。PCR的阳性率是91%（72／79），并与多参数FCM、蛋白电泳（EF）和免疫固定电泳（IF）进行比较。该方法的灵敏度在10-4～10-3。所有患者接受大剂量化疗（HDH）和自体干细胞移植（ASCT）支持治疗，中位随访平均49个月（13～76个月）。ASCT后27例（50．9%）获得CR（IF阴性）；16例（30．2%）获得NCR（near CR，IF阳性EF阴性）。27例CR患者中，19例F-PCR阴性，8例阳性，阳性患者中6例随后复发。14例NCR患者中，7例F-PCR阳性，随访中全部出现疾病进展；另外7例F-PCR阴性，4例出现进展，3例无疾病进展。当F-PCR与FCM进行比较时，51例患者进行FCM MRD检测，34例FCM检测为阳性（肿瘤细胞＞0．01%），17为阴性（＜0．01%）。34例FCM阳性患者中，23例F-PCR阳性，11例阴性。11例FCM阳性PCR阴性患者中8例无疾病进展存活，2例复发，1例死亡。17例FCM阴性患者中16例PCR阴性，1例PCR阳性并随后复发。但FCM MRD阳性和FCM MRD阴性组的总生存（OS）与无进展生存（PFS）无明显差异。F-PCR检测基因阳性与阴性组之间，OS无统计学差异，但PFS有明显差异。在IF阴性的27例患者中F-PCR阳性与阴性组之间PFS也存在显著差异。多变量分析所有变量对OS无影响，而对PFS来讲，只有FPCR结果具有预后意义。文章说明该方法的灵敏度低于ASO IgH PCR和FCM，但方法简便，无需测序合成病人特异性的引物和探针，因此便宜，可操作性强。结果与FCM具有可比性，能够鉴别强化疗后预后较好的患者。另外该研究检测的是不完全IgH重排，并同时检测了轻链重排，因此使得PCR的阳性率较高达到91%。而一般的检测完全重排只有约50%患者为阳性，而单纯检测不完全重排，阳性为75%，因此同时检测Ig重链和轻链基因重排大大提高了PCR的阳性率。

2．ASO IgH PCR　由于通用引物PCR灵敏度低的缺点，一些研究者采用ASO IgH PCR对MM患者治疗后MRD进行了研究。但多是回顾性且病例数均较少。

1999年Corradini利用ASO IgH PCR方法首次回顾性分析较大量的样本（29例）。主要选取HDH联合自体或异基因移植后获得CR患者，51例患者中34例接受自体移植（15例进行单次移植，19例接受了双次移植），17例接受了异基因移植（2例BMT，2例外周血移植（BCT））。自体移植组共有19例获得CR，其中15例具有IgH基因重排标志（4例接受单次移植，11例接受双次移植）。双次移植组中2例在随访20～21个月时一直为PCR阴性，但1例在25个月复发，另1例持续PCR阴性。在平均随访26．5（6～63个月）个月中，其余13例PCR阳性患者中8例复发。异基因组的17例患者中14例具有IgH基因重排标志，7例获得PCR阴性（1例BMT者，6例BCT），平均随访分别为26个月和18个月。而PCR阴性和PCR阳性患者中分别有一例复发。该研究认为异基因移植更容易使患者获得分子CR，PCR阴性和PCR阳性患者中复发率无明显差异。

2000年Martinelli回顾性分析了接受自体或异基因造血干细胞移植后获得CR MM患者的基因水平，229例患者中62例获得CR，其中44例具有IgH重排可供基因分析。44例患者中14例接受异基因骨髓或外周血移植，30例接受单次或2次自体移植。利用定性ASO IgH PCR方法，证明50%异基因移植患者获得了分子完全缓解（MCR），16．6%自体移植患者获得MCR（P＜0．01%）。获得MCR与未获得MCR患者无复发生存（RFS）和复发率分别为110个月与35个月（P＜0．005）16．6%与41%（P＜0．05）。说明异基因移植后更多的患者获得MCR，且获得MCR的患者有较长的RFS和较少的复发率。

2003年欧洲血液骨髓移植组（EBMT）报道了48例接受清髓性同胞相合的异基因骨髓移植患者的分子缓解状态。利用ASO IgH PCR，在移植后进行连续随访。根据PCR结果将患者分为3组，PCR持续阴性组、PCR阳性与阴性混合组和PCR持续阳性组。3组的中位随访时间为23～48个月，平均检测间隔是6～8个月。5年累积复发率分别为0、33%和100%。说明移植后基因的缓解状态与预后有相关性。

（二）荧光定量PCR

1．通用引物荧光定量PCR　国内林法迎利用SYBR GreenⅠ荧光染料，采用通用引物实时定量PCR方法，以IgH为标志，对8例多发性骨髓瘤和1例Waldenstrm巨球蛋白血症患者自体PBSCT前后的IgH基因重排进行分析。结果发现，IgH基因重排拷贝数在PBSCT前后分别为3　108±1　043，594±660，两者差异有显著性（P＜0．05），与患者骨髓浆细胞比值和外周血M蛋白量呈正相关（r＝0．86，P＜0．05），并对1例复发患者进行连续检测，结果与临床相符。作者认为该方法可以作为判断多发性骨髓瘤治疗疗效的一种检测方法，并对患者的预后判断也有意义。此种定量方法因为采用通用引物的方法，优点是不需要对每位患者进行测序分析，但它不能克服通用引物IgH PCR方法的缺点，在患者治疗后或获得CR后体内恢复正常Ig的分泌时，所检测的IgH基因的拷贝数不代表恶性克隆的基因拷贝数，因此难以反应肿瘤负荷。

2．荧光定量（RQ）ASO IgH PCR Rasmussen利用荧光定量ASO IgH PCR检测HDH联合自体PBSCT患者治疗前后BM中的MM细胞，只检测了5例患者，结果在获得临床CR的标本中全部为PCR阳性。作者比较了相同时间2次抽取骨髓标本的差异，第1次抽取2～4ml，第2次取4～20ml。结果在诊断时2次PCR结果相差41%～90%，但在CR时差异明显减少。同时采用FCM检测2次抽取标本间的差异，结果2次差异在3%～40%，作者认为这些差异反应了MM细胞在骨髓内的分布的异质性。

Fenk检测了11例接受HDH和自体移植（2例）和（或）异基因移植（2例）治疗MM患者55份BM和107份PB标本，比较BM和PB标本，显示PB中肿瘤负荷明显低于BM，IgH／2β-actin分别为0．000　023%与0．29%。治疗前和治疗后获得最大反应时，克隆细胞明显减少，平均减少了2个log。BM中由中位13%减少到0．09%（P＝0．003）；PB中由0～0．03%（P＝0．02）。复发时克隆细胞数在BM中增加到2%，PB到0．4%。诱导治疗后且PBSCT前，以0．03%作为BM阈值发现，所有复发患者均大于此值，且PB中＞0．001%。所有患者PBSCT后获得缓解者均低于此值。说明移植前克隆细胞数与复发有明显相关。但未发现M蛋白水平，骨髓浆细胞浸润，β2微球蛋白、LDH和细胞遗传学异常与复发相关。通过连续监测，5例患者获得了缓解，其中3例PCR持续阴性，2例维持在较低水平。而6例患者复发，4／6例在复发前3个月（中位，范围0．5～6个月）PCR比值增加了10倍，2例患者为CR者在PCR增加时IF仍然为阴性；另外2例为PR患者，PCR增加时EF无明显变化。2／6复发患者在PB PCR IgH／2β-actin比值增加同时出现IF由阴性变为阳性和EF M蛋白开始出现增加。说明移植前MRD水平和连续检测均可以预示复发。

总体来讲，ASO IgH PCR方法具有较高的敏感性，但在临床常规检测中可操作性低，发表的文章多是回顾性分析，因此主要适用于临床研究。而利用通用引物F-PCR方法，具有操作简便，无需合成病人特异性的引物和探针，但不是定量方法。从初步结果看，治疗后获得分子缓解者具有较好的预后。

二、多参数流式细胞术在MM MRD监测中的应用及意义

早在1993年Harada采用双色FCM报道MM细胞与正常浆细胞（NPC）免疫表型的区别，NPC为CD38st＋CD56-CD19＋VLA-4＋VLA-5＋MPC-1＋CD44＋；而MM PC与NPC最大区别是CD56＋CD19-。1999年Almeida采用三色FCM检测了21种抗体，在61例初治MM患者中，87%患者在诊断时存在PC免疫表型异常，主要为CD56（62%）CD28（16%）和CD33（6%）的过表达，及CD117（28%），表面Ig（sIg）（21%）和CD20（10%）的非同步表达。同时检测了DNA非整倍体，阳性率是62%。结合免疫表型使异常PC检出率达到95%。采用SSC／CD38CD138＋设门两步获取方法，获取最多2×106细胞。使该方法检测MRD的灵敏度达到10-5。通过检测29份干细胞采集物和18份在自体PBSCT后3个月BM标本，结果44%采集物和61%的BM标本存在异常浆细胞。他们还计算了不同时间BM内异常PC在总体PC中的比例，在诊断时、移植前和移植后分别为98%±7%、72%± 38%和28%±32%。说明多参数FCM适用于绝大多数MM患者，且只要获取的细胞数足够多，可以达到较高的灵敏度。因此显示出其优越性。

利用3组四色抗体组合采用相似的设门方法，该研究组在2002年比较了55例HDH联合自体移植和56例普通化疗的疗效。在ASCT后3个月和结束12个疗程化疗后1个月时检测MRD，结果MMPC的比例分别为0．04%和0．17%，正常PC在总体PC中的比例分别为86%和36%。而MRD阴性的比例分别为36%和15%。说明移植后可使MM PC明显减低。与EF结果相比，92%（44／48）EF出现减少患者FCM MRD阳性，而51%（20／39）EF阴性患者FCM MRD阴性。与IF相比74%获得一致的结果，60%均为阳性和14%均为阴性。有14%IF阴性而FCM阳性，12%IF阳性FCM阴性。分析MRD水平与PFS的关系，只有在N-PC／总PC比值以30%作为临界值时有显著性差异。当NPC比例高时PFS明显延长。该研究说明FCM MRD检测是一种快速，易于标准化和敏感的方法，可以提供有价值的预后信息。

2005年该研究组比较了ASOTaqMan实时定量PCR（ASO-RQ-PCR）与FCM MRD结果。主要检测移植后获得CR患者MRD水平。结果ASO-RQ-PCR适用于75%的患者，而FCM为90%，75%患者同时存在基因和免疫表型异常。而2种方法所检测的肿瘤细胞数非常相似，相关系数是0．861。但PCR检测MRD阳性患者多于FCM（17例与11例），有6例FCM阴性患者而PCR阳性。6例患者PCR值均较低（平均0．014%），说明PCR的灵敏度高于FCM。以0．01%作为临界值分析PFS，2种方法均可鉴别出2种危险度不同的患者。该研究认为虽然ASO-RQ-PCR方法的灵敏度和特异性比FCM稍高，但PCR适用于较少的患者而且耗时，更重要的是2种方法提供了相似的预后信息。

最近Paiva报道了大宗样本FCM MRD检测的前瞻性研究，作者研究了295例新诊断的MM患者采用相同的化疗后联合自体移植的支持治疗的疗效，同样采用4色抗体组合2步获取方法，证明在MRD检测时CD38、CD56、CD19、CD45用于90%以上的患者，其余患者根据初治时的免疫表型异常增加1～2组抗体组合，选用CD28、CD117、CD33或CD20。FCM检测的灵敏度在10-4。在ASCT后100d时进行MRD检测，147例（50%）患者获得CR；40例（14%）获得了nCR，108（36%）例PR。截止到文章的随访期，173例（59%）出现复发或疾病进展，91例（31%）死亡；中位随访期57个月（范围：3～127个月）。295例患者的中位PFS和OS是48个月和98个月。中位PC水平是0．26%（平均0．57%±1．33%SD）。170例（58%）患者MRD阳性，中位MMPC水平为0．14%（范围：0．01%～4%），其余患者MMPC＜0．01%，认为是MRD阴性。ASCT后100d时MRD阴性患者有显著延长的PFS（中位71个月与37个月；P＜0．001）和OS（中位未达到与89个月；P＝0．002）。MRD阴性组和MRD阳性组5年PFS分别是60%与22%（P＜0．001），预期的5年OS分别为82%和60%（P＝0．002）。当FCM结果与IF结果进行比较时，将患者分为3组，FCM-IF-；FCM-IF＋；FCM＋IF-，前2组患者的PFS明显比后者长（中位71个月，65个月和37个月，P＝0．001）。多变量分析显示只有FCM MRD状态和FISH遗传学分析为PFS独立预后因素；FCM MRD状态和年龄是OS的独立预后因素。作者还分析了移植前后MRD状态与预后的关系，移植前后MRD均阳性患者中位PFS最短为40个月（n＝90）；移植前阳性移植后变为阴性者（n＝48）具有中间的PFS（71个月），而移植前后均为阴性者（n＝16）PFS最长，未达到中位值。3组5年PFS分别为25%、57%和80%，5年OS分别为59%，78%和100%。这篇文章充分证明了FCM MRD检测的重要性。如此大量的样本，是难以利用ASO PCR来完成的。但目前的治疗需要较敏感的MRD检测方法，因此多参数FCM是值得利用和推广的MM患者MRD检测的方法，可为临床治疗和预后判断提供可靠的指标。

2008年Rawstron报道了欧洲骨髓瘤网有关多参数FCM在多发性骨髓瘤和相关疾病应用的报道，以问卷的形式报道了一些相关问题的一致性观点和解决的方法。可以作为今后开展FCM MRD检测的借鉴。

虽然目前FCM在MM诊断和监测中主要限于临床研究和少见病例的鉴别诊断上，但由于浆细胞具有特征性免疫标志，并且MM细胞具有异常的免疫标志使我们能够鉴别正常与异常PC，意味着即使在数量较少的情况下仍能鉴别和计数肿瘤细胞。FCM在诊断和监测单克隆伽马病的优势归为3大点：①基于对BM PC的计数、并证明表型异常，克隆性和非反应性浆细胞的比例，成为MM和相关疾病诊断的基本方法。由于FCM可以联合克隆性检测和多个免疫标志使其比其他方法如免疫组化提供更多的特异信息。②提供独立的预后因素，尤其是对于意义不明的单克隆伽马病（MGUS）和无症状的骨髓瘤患者通过检测异常PC在总体PC中的相对比例可以预测疾病的进展。③定量评估MRD以评价疗效和预示预后，及定义国际骨髓瘤工作组（IMWG）确定的严格意义的CR。FCM应用的问题和一致的观点如下。

1．PC计数　FCM计数PC与形态存在偏差，这种偏差存在于所有的实验室，包括细胞遗传学，FISH和分子实验室。主要原因是标本抽取时采用2步抽取所致，第一步给形态第二步给实验室。然而最近的研究证明FCM计数PC比形态学具有更大的预后价值。PC计数一致观点是，目前的诊断标准需要形态评估PC比例，这样有助于提供全球的标本评估。形态与FCM计数PC比例的偏差是由于标本质量所致，如果采用第一步抽取的标本可能大大去除这种影响。FCM计数PC因分析大量的细胞及较少操作误差，因此比形态学方法可能更具有重复性和对预示预后上更可靠。但这些需要进一步证实。

2．鉴别诊断MM和单克隆伽马病　免疫分型被推荐作为鉴别MM与MGUS的方法，在诊断时确定肿瘤细胞的异常表型有助于治疗后MRD的监测。免疫分型有助于鉴别少见病例如IgM型MM、非分泌型MM和原发性淀粉样变的患者。另外免疫分型有助于鉴别潜在的治疗靶点，如CD52和CD20表达。一致观点是：证明存在免疫表型异常的PC有助于鉴别MGDS、MM和反应性浆细胞增多。

3．鉴别预后标志和筛选细胞遗传学异常　目前没有清楚证明免疫表型与预后的价值，也没有足够的证据证明免疫表型用于筛选细胞遗传学异常。有报道显示检测循环的PC和CD45的表达模式有较大的预后意义，但需要进一步证实。目前证明最有用的预后指标是对MUGS与无症状MM患者，当出现异常PC与正常PC比例较高时则有较大的疾病进展的危险性。预后标志的一致观点是：几个标志组合，特别是CD117和CD28具有预示作用。但免疫分型对筛选遗传学异常上作用有限；需要实验室间合作进一步评价CD45的预后意义；表型正常PC与异常PC的比例可预示MUGS与无症状MM患者疾病进展。

4．用FCM检测MRD　利用血清和尿M蛋白来评价治疗反应受免疫球蛋白具有较长半衰期的限制，而血清游离轻链也是相对不敏感的。直接检测BM中的肿瘤负荷具有更强的预后作用。ASO PCR具有较高的敏感性，但费用较高，费时，限制其应用。利用FCM可以监测肿瘤浆细胞，当大于临床相关的0．01%阈值时，比传统的方法具有更大的信息。FCM几乎可以用于所有MM患者MRD的检测，比M蛋白和轻链更敏感，并且比PCR便宜。一致观点：多参数FCM是一种检测MRD和评估疗效可行和适当的方法。应用FCM已经变的更广泛了，需要建立具有确定特异性和敏感性的标准化方法和适当的质量控制体系。

5．正常和异常PC抗原表达　目前所用的抗原没有一个单独的抗原能够鉴别正常和异常的PC，建议采用CD38、CD138、CD45与SSC进行设门分析，除此外，最少的抗原还要包括CD19和CD56，这组抗体组合适于至少90%的患者，增加CD20、CD117、CD28和CD27可以增加到95%，因此最好同时检测这些抗原。

除去这些因素，标本的质量也非常重要，BM标本经常被PB稀释，这样会低估MRD的水平。判断BM标本是否被稀释可以通过检测标本中正常PC来确定，正常BM应该存在正常PC，而当BM中只存在异常PC，及BM中应该存在的细胞，如红系、髓系和B系祖细胞均不存在时，很可能BM标本已经被稀释了。此时报道中应该声明此份标本不适于定量MRD。

总之FCM方法具有适用范围广，灵敏度高，可操作性强，能够定量的优点，因此适用于临床MM MRD的检测。F-PCR方法如果同时检测Ig重链和轻链基因及不完全重排可以增加阳性率。采用通用引物大大减少检测费用和时间，适用于临床大宗标本的前瞻性研究，缺点是定性非定量。ASO PCR的主要优点是灵敏度和特异性最高，但可操作性差，不适于临床的常规检测。当FCM与RQ ASO PCR比较时，部分患者PCR阳性而FCM阴性，原因除去PCR较灵敏外，也有报道显示MM患者存在克隆性的B祖细胞，认为是MM的祖细胞。PCR方法可以检测所有克隆性细胞，包括浆细胞和B细胞。但FCM主要检测异常PC，这可能造成PCR阳性而FCM阴性的另一种原因。但这种克隆的恶性潜能没有明确，预后不确定。

目前不论采用PCR或FCM方法，以0．01%左右（0．01%～0．03%）作为阈值可以确定严格意义的完全缓解，这样的患者具有较好的预后，尤其是应用大剂量化疗联合自体或异基因造血干细胞移植后。治疗后MRD的状态具有预后意义，因此需要对MRD进行监测。

（刘艳荣）