树突状细胞介导的免疫治疗

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是B细胞来源的恶性肿瘤。化疗和造血干细胞移植等综合治疗，可获得较高的缓解率，但患者在常规治疗达完全缓解后，体内仍有残存的骨髓瘤细胞，成为复发的根源。因而根除微小残留病（minimal residual disease，MRD）能进一步改善骨髓瘤病人的预后。此时依靠机体有效的抗肿瘤免疫反应是消除MRD的一个有效方法。免疫治疗具有毒性低，特异性强的特点，在骨髓瘤治疗中拥有广阔前景。而树突状细胞（Dendritic cell，DC）为基础的免疫治疗是近几年来治疗骨髓瘤的热点之一。树突状细胞是目前功能最强大、唯一能激活初始型T细胞的抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC），能有效的把骨髓瘤的肿瘤抗原呈递给T细胞，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞而达到杀灭骨髓瘤细胞的目的。多发性骨髓瘤分泌的单克隆免疫球蛋白（M蛋白）具有独特型抗原决定簇，可作为肿瘤靶抗原，在DC的介导下，激活体内独特型特异的MHC-Ⅰ类限制性T细胞反应。以DC为基础的免疫治疗策略应用于多发性骨髓瘤，特别是干细胞移植后微小残留病变的治疗，效果较好。

一、树突状细胞的生物学特征

树突状细胞（dendritic cell，DC）是1973年由Steinman首先在小鼠脾脏中分离出来并发现其免疫功能，此后20年间，DC在各种组织中被发现，并能够在体外进行培养。由于这类细胞具有长的胞浆突起，被命名为树突状细胞。DC外形不规则，细胞核大、不规则，胞质较少，向周围发出突起，呈树突状。目前认为，具有典型的树突状形态、高表达MHC-I类、MHC-II类分子、具有一些相对特异性表面标志，并能够刺激初始型T细胞（Naive T cells）增殖活化的细胞，才能称为DC。

1．树突状细胞的来源　DC由骨髓CD34＋造血细胞分化而来。DC的前体细胞在初始阶段具有增殖能力，而在一定阶段其前体细胞变为不可增殖如外周血单核细胞，根据DC前体细胞来源，体内DC主要分为髓系相关DC（Myeloid-lineage DC）和淋巴系相关DC（Lympoid-lineage DC）两大类，它们来源于各自的前体细胞。髓系DC包括血液DC、朗格汉斯细胞、生发中心DC等。它们与单核、粒细胞有共同的祖细胞，能够分化为巨噬细胞。淋巴系DC包括胸腺内DC等。它们与T细胞、NK细胞有共同的前体细胞，能分化为淋巴细胞。

2．树突状细胞的分化发育　随着对DC研究的深入，对于DC的分化发育过程，目前已知DC的前体细胞由骨髓进入血液，随血循环流至非淋巴组织，发育为非成熟DC。这时的DC表达低水平的共刺激分子和黏附分子，在体外激发混合淋巴细胞反应的能力较弱，但是具有很强的抗原捕获和加工能力，通过巨泡饮、受体介导的内吞及吞噬等方式摄入外源性抗原，加工后与MHC-Ⅱ类分子结合为复合物提呈于DC表面。通过巨泡饮及吞噬摄入的外源性抗原也可通过MHC-I类途径提呈。在炎症介导因子（如LPS、TNF-α）和“危险信号”的作用下，DC迁移至次级淋巴器官并成熟。成熟DC的表面MHC-Ⅱ类分子、共刺激分子和黏附分子的表达显著提高，体外激发混合淋巴细胞反应的能力很强，但失去了大部分摄取加工抗原的能力。成熟的DC能够吸引、活化幼稚T细胞并与之相互作用，从而启动初级免疫反应。外源性抗原可以以凋亡小体的形式被DC摄取，通过MHC-I类分子递呈。

3．树突状细胞的生物学特性　DC是体内最重要的抗原递呈细胞（APC）。其特点在于：①是体内唯一能激活初始型T细胞的APC，能把抗原递呈给初始型T细胞，并能有效刺激自体或异体T细胞，使之激活，用少量的抗原和DC作用即足以激活T细胞，DC激活T细胞的能力是巨噬细胞或B细胞的100～10　000倍；其他APCs仅能刺激记忆性T细胞。②成熟的DC高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子产物、丰富的共刺激分子、黏附分子。③DC在一些激活信号（CD40或LPS）处理后可产生大量的IL-12，后者可调节T细胞和NK细胞功能，促进Th0朝Th1方向分化，显著影响Th1、Th2的平衡。④DC主要通过胞饮作用、受体方式及吞噬方式摄取抗原及处理抗原，并迁移至T细胞区域，有一个成熟的过程。

4．树突状细胞表面抗原与受体　DC前体细胞不存在特异性的DC标志。在细胞因子GMCSF、IL-3、IL-4等作用下，DC前体细胞向幼稚DC分化。开始有MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ类分子的表达，低表达CCR7、CD54、CD58、CD80、CD86，CD40和CD83，高表达CCR1，CCR5，CCR6和FcR。幼稚DC有较强的胞饮及受体介导的内吞作用，有较强的吞噬外来分子抗原的作用。随着抗原被吞入胞内，幼稚DC逐渐趋向成熟。成熟DC中MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ类分子、CD80（B7-1）CD86（B7-2）等表达上调。成熟DC的表型特征是高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40、CD54（ICAM-1）和HSP等免疫刺激分子及特异性抗原，表达CD1a和CD83是人成熟DC标志。

5．树突状细胞的体内分布　人体中DC的数目较少，仅相当于单核细胞成分的1%左右，但分布极广，除脑组织外，身体其他组织器官中均发现DC。

二、DC抗多发性骨髓瘤的机制

多发性骨髓瘤能逃避机体免疫系统的监视，主要因为骨髓瘤细胞可以通过下调骨髓瘤相关抗原、组织相容性复合物抗原和共刺激分子，或通过分泌免疫抑制因子来逃避免疫监视，因此进行骨髓瘤免疫调控的关键是要调整骨髓瘤细胞免疫过程中T细胞功能状态。骨髓瘤细胞表达骨髓瘤相关抗原和骨髓瘤独特性抗原，适于进行免疫治疗。在抗骨髓瘤免疫反应中，DC对骨髓瘤抗原进行捕获及处理，经各种水解途径，消化抗原，使抗原物质降解为多肽。同时DC产生大量的MHC分子，进行MHC-多肽复合物的装配，是其强大抗原递呈作用的重要保证。伴随抗原的摄取、处理和转运过程，DC发生迁移。DC迁移到淋巴组织中，围绕在T细胞周围，T细胞得到DC提呈的骨髓瘤抗原而被激活，产生特异性的CTL。DC将抗原提呈给T细胞主要是通过MHC途径：MHC-Ⅰ类分子与T细胞的TCR结合，把内源性多肽递呈给CD8＋杀伤性T细胞；MHC-Ⅱ类分子与TCR结合，把抗原多肽递呈给CD4＋辅助性T细胞。DC在迁移的过程中逐渐发育成熟，抗原递呈能力增强。树突状细胞介导的免疫治疗最主要的工作是在体外培养扩增DC，利用抗原或抗原多肽冲击致敏，然后将致敏的DC回输至宿主体内进行免疫治疗。

三、多发性骨髓瘤的靶抗原

多发性骨髓瘤免疫治疗具有毒性低、特异性强的优点，具有广阔的临床应用前景。而选择合适的抗原是骨髓瘤免疫治疗中的首要前提。目前发现的多发性骨髓瘤的靶抗原包括骨髓瘤独特型蛋白、Ⅱ型跨膜糖蛋白HM1．24、精子蛋白17（Sp17）、DKK1抗原等。

1．多发性骨髓瘤分泌均一的被称为骨髓瘤蛋白的单克隆免疫球蛋白Ig或Ig片段，骨髓瘤蛋白可变区对浆细胞肿瘤来说是特有的，具有独特的抗原决定簇。被称为独特型（idiotype，Id），是多发性骨髓瘤的肿瘤特异性标志。针对Id的免疫治疗可阻止骨髓瘤进展。当多发性骨髓瘤分泌一定量的Id时，这些骨髓瘤抗原经过DCs的摄取、加工、递呈给淋巴细胞，由此产生抗骨髓瘤的特异性免疫，从而使骨髓瘤的生长受到阻滞。实验研究显示：DC在摄取抗原后经过加工处理首先提呈给CD4＋T细胞，激发的CD4＋T细胞表达CD40配体（CD40L），CD40L通过与DC表面的CD40受体结合和相互作用提供给DC第二信号，使DC进一步活化，活化的DC继而激活CD8＋T细胞，使其杀伤骨髓瘤细胞。Bogen等证实了抗Id的细胞毒性T细胞能够通过MHC-Ⅰ型限制、穿孔素介导的途径特异性杀伤自体骨髓瘤细胞。另外，Th1细胞分泌γ干扰素和IL-2的同时也参与了细胞调节的免疫应答，诱导CD8＋CTL的产生；Th2细胞能够产生IL-4，并且可以通过刺激抗体的产生激发体液免疫应答。

⒉最近研究发现骨髓瘤细胞高度特异性表达抗原HM1．24，它是1种Ⅱ型跨膜糖蛋白，被认为是骨髓瘤免疫治疗的靶分子。Steven等的实验证实了以HM1．24抗原蛋白加载DC能刺激机体产生抗肿瘤的CTL，可直接对抗HM1．24引起骨髓瘤细胞凋亡，故HM1．24被认为是1个有前景的靶抗原。Jalili等的研究提示骨髓瘤病人外周血干细胞中存在功能性的DCs和HM1．24特异性CTLs前体细胞，其诱导出的CTLs可以HLA-限制性的方式杀灭骨髓瘤细胞。

3．骨髓瘤独特型蛋白免疫原性相对弱，杀伤效应低。CT（cancer testis）抗原是1类肿瘤特异性抗原，限制性地表达于正常睾丸生殖细胞、卵巢、胎盘及肿瘤组织，而在其他组织没有表达。自1990年Boon及其同事建立了首个肿瘤CT抗原的T细胞克隆以来，目前已有44种CT抗原被确定，且50%以上能在体内有效激发体液免疫及细胞免疫。因其在恶性肿瘤组织选择性的表达及高免疫原性，CT抗原被视为肿瘤免疫治疗的理想靶标。精子蛋白17（Sperm protein l7，Spl7）作为一种CT抗原，首先在30%的骨髓瘤病人中检测到了mRNA和蛋白表达，随后于卵巢癌，恶性淋巴瘤及多种肿瘤细胞系中也发现其表达。用输精管切除后的男性血清进行细胞表位图谱分析，发现Spl7不仅含有大量的B细胞表位，还含有功能性细胞毒性T细胞（CTL）表位，所以Spl7可以用作肿瘤疫苗的靶标。Chiriva-Internati等对4例MM的DC装载Sp17，其中有3例持续Sp17阳性，1例Sp17阴性，结果均能诱导产生特异性CTLs，并能有效地溶解Sp17表达阳性的骨髓瘤细胞。

4．另外，近来有学者报道MM来源的热休克蛋白gp96，血管内皮细胞生长因子ECGF-1也可作为靶抗原，进行MM的免疫治疗。最近发现DKK1也是有潜力的骨髓瘤相关抗原。

四、DC的体外扩增培养

人体中DC的数目较少，外周血淋巴细胞中DC的比例不到1%，在淋巴器官中数量稍多但难以收集，需体外培养扩增足够数量及有良好功能的DC。使临床应用DC进行骨髓瘤的免疫治疗成为可能。

DC的体外扩增。DC主要来源于骨髓的CD34＋造血干细胞和外周血单核细胞。从外周血单核细胞获取DC时，可采用白细胞单采术直接获取PBMCs，也可以在抽取外周血后用Ficol1分离法获取PBMCs，利用细胞黏附和密度梯度离心的方法从人PBMC中分离DC，其纯度低，数量少。1992年，Steinman实验室首先建立了用重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）从小鼠骨髓中大规模培养制备DC的方法，很快有人用GM-CSF加IL-4从PBMC或用GM-CSF加TNF-α从CD34＋造血干细胞中扩增出大量的DC。扩增的DCs的来源包括骨髓、脐血、外周血中的CD34＋细胞及单核细胞。常使用过的获得DC的方法包括①直接分离外周血中的DCs；②外周血CD34＋细胞源性的DCs培养；③骨髓CD34＋干细胞；④外周血CD14＋单核细胞源性DC培养等。前2种方法由于操作过程复杂，得率较低等问题较少应用，后2种方法由于采样程序简单，需血样量少，不涉及复杂的筛选和纯化，所用细胞因子组织简单，故为大多数临床研究人员利用，并逐渐形成相对固定的培养模式，其缺点是DC体外的时间较长，增加了污染的可能性，DC的体外培养中所用的细胞因子为GM-CSF、IL-4、TNF-α，GM-CSF是髓系细胞发育的必需细胞因子，TNF-α或CD40配体可阻止粒系的分化而刺激DC的成熟，IL-4的加入则抑制了单核细胞向巨噬细胞分化的潜能，并维持DC的成熟。它们在DC的体外培养中对维持DC的分化发育，使DC处于未成熟状态以具有很强的抗原提呈作用以及促使DC成熟从而激活T细胞发挥重要作用。

DC体外培养时培养基中可以加胎牛血清、混合人（AB型）血清或自身血清，也可以使用无血清培养液培养。目前，临床应用倾向于无血清培养DC，主要因为：①胎牛血清含有异种蛋白，容易过敏；②混合人（AB型）血清培养基中血清中复杂的蛋白和抗原成分可能封闭DC表面抗原结合位点，影响DC抗原提呈功能，而且血清蛋白酶会改变DC摄取的肽类抗原的抗原；③患者自体血清中可能含抑制因素，如血管内皮生长因子和白细胞介素-10等，影响DC分化和成熟。无血清培养则克服了上述缺点，是DC介导免疫治疗应用于临床的前提。

五、多发性骨髓瘤DC瘤苗的制备

1．个体独特型Ig直接负载DC　将DC置于个体独特型Id的溶液中，即产生受抗原刺激的DC。其注入体内后摄取、处理和提呈抗原表位，诱导产生抗原特异的CTLs，达到免疫治疗的作用。此方法简单易行，能较好的在体内引起抗肿瘤免疫反应。临床试验研究显示，自体单核细胞诱导出的DC负载自体Id后，可以分泌Th1相关细胞因子，同时在体外激发产生针对自体MM细胞的CTL免疫应答。

2．基因修饰DC疫苗　利用基因转导方法，将肿瘤抗原或细胞因子、共刺激分子等基因转入DC前体细胞中，可产生大量特异性诱导的DC，这种方法技术复杂，且费用很高。动物实验证实该法可诱导抗原特异的CTL反应，肿瘤负荷减少，生存时间延长。

3．骨髓瘤细胞与DC融合　DC与骨髓瘤细胞在体外进行杂交融合，获得的杂交瘤细胞能同时表达DC的表面分子及骨髓瘤相关抗原，注入体内能有效地激发骨髓瘤特异的CTLs，介导免疫治疗。这种方法最大的优点是能以MHC-抗原复合物的形式提呈天然的完整的骨髓瘤抗原，符合自然状态下的抗骨髓瘤免疫过程。融合技术包括电脉冲诱导融合和化学诱导融合。电脉冲诱导融合（即电穿孔技术）的效率最高，比化学融合剂（如聚乙二醇）诱导方法提高1～2数量级，实验证明电融合技术融合的DC疫苗免疫接种小鼠，可产生有效的抗肿瘤效应。未成熟的DC可通过与肿瘤细胞混合的方式，获得较好的抗原捕获效果，成熟的DC则需通过与骨髓瘤细胞融合手段负载抗原。融合后须经7～14d的培养并进行细胞筛选，以防混入肿瘤细胞。这种方法费时费力。

4．骨髓瘤细胞冻融物刺激DC　通过反复冻融骨髓瘤细胞后致敏DC，能产生特异性CTL及保护性免疫反应。此法可诱导广泛的T细胞反应。独特型蛋白具有肿瘤特异性，但其免疫原性很弱，骨髓瘤细胞本身含有多种肿瘤抗原，其对抗肿瘤T细胞的刺激更为有效。用MM肿瘤细胞的冻融物冲击DC，在反复刺激后，建立起特异性的CTL系，同时含有CD4＋细胞及CD8＋T细胞。这些T细胞不仅能识别经抗原冲击的DC细胞，还具有溶解DC细胞的作用，同时还能特异性地杀伤自身的肿瘤细胞。Wen等报道了负载骨髓瘤细胞冻融物的DC激发产生抗骨髓瘤的CTL应答的研究，结果在所有4例患者中都发现了相应的免疫应答，表明骨髓瘤细胞冻融物能够加强CTL杀伤力。用自身MM细胞的冻融物冲击的DC瘤苗治疗效果可能会优于用独特型蛋白冲击的DC瘤苗。

六、DC在骨髓瘤免疫治疗中的临床应用

多发性骨髓瘤是B细胞来源的恶性肿瘤。化疗和造血干细胞移植等综合治疗获得缓解后，体内仍有残存的骨髓瘤细胞，此时依靠机体有效的抗肿瘤免疫反应可进一步根除微小残留病，改善骨髓瘤病人的预后。

1．在骨髓瘤化疗后应用　多发性骨髓瘤分泌的M蛋白携带独特型抗原决定簇，作为肿瘤相关抗原能刺激活化DC，产生抗肿瘤免疫效应。Liso等采用独特型抗原肽负载DC治疗26例多发性骨髓瘤患者，结果有24例产生了钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin KLH）特异性的细胞增殖反应，4例产生了Id特异性的细胞增殖反应，其中3例病灶完全消退。钥孔血蓝蛋白是1种从软体动物中提取的血蓝素，常用作哺乳动物的实验抗原。KLH并不等同于MM独特型，前者的免疫原性明显强于后者，是后者的20～50倍。26例患者在平均30个月的随访时间内，17例生存。Dabadghao等以多发性骨髓瘤的M蛋白成分刺激诱导产生成熟DC，5例骨髓瘤患者都能诱导产生特异性的树突状细胞。树突状细胞诱导产生的特异性免疫反应明显强于单核细胞诱导的反应。Titzer等以多发性骨髓瘤独特型抗原作为肿瘤相关抗原冲击DC，并隔周输注3次抗原冲击的DC，治疗11例进展期多发性骨髓瘤。治疗不良反应轻，病人耐受良好。5例患者有明显的反应，其中4例出现特异性T细胞免疫反应，有1例患者骨髓中MM细胞明显减少。以多发性骨髓瘤独特型抗原刺激DC，制备DC疫苗，应用于多发性骨髓瘤患者，临床观察有明显疗效。Yi等对5例经大剂量化疗后处于PR的MM患者用DC瘤苗治疗，结果4例患者产生了Id特异性的T细胞免疫应答，1例血M-蛋白浓度下降50%达6个月，3例病情持续稳定6个月，1例无反应。

2．在造血干细胞移植后应用　无论是自体移植还是异基因移植，在移植后仍有部分病人出现复发。因此减少移植后复发仍然是当前造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤的一个重要课题。多发性骨髓瘤抗原冲击免疫的DC，应用于骨髓瘤造血干细胞移植后，可明显减少移植病人的复发，提高无病生存率，应用供者来源的活化的DC，也能有效治疗骨髓瘤异基因移植后的复发。Avigan，D等应用对19例多发性骨髓瘤自体干细胞移植后输注3次骨髓瘤细胞融合的自身DCs疫苗，DCs单核细胞与GM-CSF、IL-4共培养5～7d，TNF-a促进DC成熟，DC高表达共刺激分子及一些成熟标志。18例患者完成疫苗的制备，培养的DC及骨髓瘤细胞数量均值分别为1．84×108、8．3×107，产生的融合细胞为4．3×106，融合效率为40%，DC作为1种APC，在体外能显著刺激异源T细胞的增殖，疫苗的不良反应包括注射部位不适、瘙痒症、肌痛、发热、寒战、心动过速。所有患者经过移植获得PR，18例患者中6例完成随访，3例正在进行疫苗输注，3例患者疫苗输注后出现M蛋白溶解，1例高危患者自体移植后早期即出现疾病进展，疫苗输注后疾病处于稳定不再进展。Reichardt等在多发性骨髓瘤外周血干细胞移植（PBSCT）后3～7个月，每个月输注用骨髓瘤细胞特异蛋白免疫激活的自体DC，并皮下注射佐剂治疗12例，有2例产生特异性抗骨髓瘤细胞的免疫反应，获得长期完全缓解。随访观察16个月，9例仍然存活。该组研究者后来报道1组造血干细胞移植后治疗的多发性骨髓瘤患者以独特型抗原激活的DC疫苗，26例中24例产生了反应。观察时间30个月，有17例仍然生存，提示DC疫苗用于自体PBSCT后的多发性骨髓瘤是可行的，能获得对独特型抗原的细胞免疫反应，杀伤多发性骨髓瘤细胞。Ⅰ／Ⅱ期临床研究对15例多发性骨髓瘤患者自体造血干细胞移植后进行DC免疫治疗，其中6例CD14＋单核细胞来源的DC负载骨髓瘤完整的Id，另9例DC负载Id来源的MHC-I限制的抗原肽和KLH，疫苗由3次皮下注射和2次静脉注射组成，间隔2周，DC治疗耐受性良好，15例患者中8例出现Id特异性T细胞增殖反应，中位随访26个月，7／15例疾病持续稳定，1例患者PR持续40个月，另7例患者疾病进展。应用供者来源的活化的DC，能有效治疗多发性骨髓瘤异基因移植后的复发。Bendandi M等对4例异基因移植后复发且对供体淋巴细胞输注和再诱导化疗无效的MM患者进行免疫治疗，4例MM患者联合应用Id脉冲的异基因DC疫苗和可溶性蛋白Id与KLH结合脉冲DC的疫苗，4例患者中2例有短暂有效，1例疾病不再进展。

七、DC疫苗治疗MM的影响因素

DC疫苗治疗MM的效果受多因素的影响。

1．体内MM的肿瘤负荷的影响。在肿瘤负荷很大时，免疫系统失去监视功能，免疫治疗难以完全杀灭肿瘤细胞，不易取得缓解，故多用于化、放疗后和（或）HSCT后消除体内MRD。

2．装载不同的骨髓瘤Id抗原的DCs，产生的免疫反应也不一样。完整的骨髓瘤Id抗原性较弱，小片段的Id抗原蛋白能诱导产生更强的免疫反应。

总之，DC疫苗是抗肿瘤免疫治疗的新方向。根据目前所进行的临床试验，可以说DC疫苗用于人体是安全的，但治疗方案必须个体化、最优化。疫苗的制备方案、具体注射剂量及途径、与其他佐剂联合应用等问题有待进一步的临床实践和探索。

（吴德沛）