单克隆抗体的应用

IL-6／IL-6R，胰岛素样生长因子I（IGF-I），成纤维生长因子（FGF）和成纤维生长因子受体3（FGFR3）等细胞因子在多发性骨髓瘤细胞生长，生存，分化中起着重要的作用。β2-微球蛋白（β2M）和CD20在骨髓瘤细胞中的高表达，并预示着患者的预后较差。近10年来，针对上述细胞因子的抑制药的开发为多发性骨髓瘤患者带来了新的希望。针对CD40、β2-微球蛋白、成纤维生长因子受体3等的单克隆抗体已经或正在进行临床前研究，这些研究为今后的临床应用将提供丰富的理论基础。也有部分单克隆抗体已用于临床，但为数很少。

一、抗白介素-6（IL-6）抗体

IL-6是多发性骨髓瘤细胞生存，增殖的最重要的细胞因子，能阻止由地塞米松和化疗介导的骨髓瘤细胞的凋亡。多发性骨髓瘤患者的血清IL-6水平和可溶性IL-6受体水平的过度表达，与多发性骨髓瘤患者的预后密切相关。

10多年前已经在体外的骨髓瘤细胞株和原代多发性骨髓瘤细胞的短期培养证明抗IL-6的单克隆抗体能阻止骨髓瘤细胞的增殖。阻断IL-6能增加地塞米松介导的骨髓瘤细胞的凋亡，提高瘤细胞对化疗药物的敏感性。早期曾使用抗IL-6抗体治疗终末期的多发性骨髓瘤患者，抗体能抑制骨髓瘤细胞的增殖，同时还能减少IL-6的相关毒性反应（如发热，恶病质等）。尽管抗IL-6抗体具有一定的疗效，但由于多发性骨髓瘤患者含有大量的内源性IL-6，而抗IL-6抗体不能完全中和IL-6，因此抗IL-6抗体在临床上应用受到了很大的限制。目前，临床上还没有单一使用抗IL-6的抗体来治疗多发性骨髓瘤。

Rossi等于2005年报道了抗IL-6单克隆抗体联合地塞米松、大剂量美法仑治疗多发性骨髓瘤的多中心临床对照研究：24例患者接受地塞米松（40mg／d，5～2d）、大剂量美法仑（HDM 140mg／m2，2d），然后做自体外周血干细胞移植（0d）。所有病人都接受人抗IL-6单抗（BE-8，IgG1），200mg（6d），20mg／d（从5d起，直到造血恢复）。结果发现多发性骨髓瘤患者接受大剂量美法仑和自体干细胞移植后体内IL-6水平急剧上升，较前增加100倍，这样可能使少数的骨髓瘤细胞逃避了化疗药物的杀伤，或可能减轻美法仑对骨髓瘤细胞DNA的损伤，引起骨髓瘤细胞对化疗药物的耐药。采用长半衰期的人抗IL-6抗体，每天注射直到造血恢复，能保证血浆中抗IL-6单克隆抗体的浓度，能有效地中和高浓度的IL-6，降低血浆中IL-6出现的高峰（IL-6的水平达到320μg／d就不能被抗体完全中和），而且阻断IL-6的抗凋亡的作用，延长化疗药物，包括美法仑的最大杀伤骨髓瘤细胞的时间。同时还观察到抗IL-6单克隆抗体能更长时间的阻断C反应蛋白（CRP）的作用，使接受HDM后血浆中CRP的浓度降低，减少患者与CRP有关的发热、黏膜炎和其他的一些并发症。抗IL-6单克隆抗体并不延迟中性粒细胞和血小板的恢复时间，还能减少患者红细胞的输注量。经过72个月的随访，中位无事件生存（EFS）达到35个月，5年的总体生存率（OS）为68．2%。

Moreau P等用鼠源性抗IL-6单克隆抗体（BE-8）联合地塞米松、大剂量美法仑治疗16例进展期的多发性骨髓瘤患者，患者获得较高的完全缓解率，同时并不增加高剂量化疗的毒性。

Voorhees等通过一个多发性骨髓瘤的临床前的试验模型发现抗IL-6的单克隆抗体CNTO328能通过抑制IL-6的信号而增强蛋白酶体抑制药硼替佐米的细胞毒作用。单一CNTO328能抑制IL-6依赖细胞株（ANBL-6和KAS-6／1）的增殖，且呈剂量依赖关系。CNTO328联合硼替佐米不仅对IL-6依赖细胞有增强硼替佐米的细胞毒作用，而且对非IL-6依赖细胞株（H-929，MM1．S和RPMI8226）也有同样的作用，并且CNTO328和硼替佐米联合使用的顺序也具有一定的依赖性。先用CNTO328处理再用硼替佐米和两者同时使用对骨髓瘤细胞的细胞毒作用明显大于先用硼替佐米再用CNTO328。CNTO328同样在来源于不同疾病时期的原代骨髓瘤细胞也能见到明显类似的促进硼替佐米的细胞毒作用。虽然单独的CNTO328或硼替佐米对IL-6依赖细胞株的凋亡率在8%到56%，但两者联合，80%的细胞出现死亡。同样，CNTO328虽不能导致非IL-6依赖细胞株的凋亡，但能很强的增强硼替佐米的促凋亡作用。

Voorhees等在该试验中对CNTO328增强硼替佐米对骨髓瘤细胞的促凋亡和细胞毒作用的机制进行研究。①虽然抗IL-6单克隆抗体CNTO328不能激活caspase-3，caspase-8，caspase-9，但能增强硼替佐米激活caspase-3，caspase-8，caspase-9的作用，从而促进细胞凋亡；②CNTO328能抑制IL-6引起的P44／42MARK的激活，促进硼替佐米减少细胞内被激活的P42和P44MARK的含量，同时减低P42和P44 MARK磷酸化水平；③CNTO328抑制STAT-1的磷酸化，完全抑制通过STAT-1的信号，调节HSP-70的表达水平，但不影响STAT-1的总体水平；④CNTO328废除白介素依赖细胞株IL-6引起的STAT-3的磷酸化，调节HSP-70的表达水平。

抗IL-6的单克隆抗体目前在临床中应用的报道非常少，主要是临床前的试验，其原因是多方面的，一是由于多发性骨髓瘤患者含有大量的内源性的IL-6，而抗IL-6抗体不能完全中和体内IL-6，需要再联合其他的抗肿瘤药物，才能发挥其最大的疗效；二是目前有较好的治疗多发性骨髓瘤药物：包括蛋白酶体抑制药和免疫调节药，因此抗IL-6抗体目前还不是临床研究的热点。

二、抗CD40单克隆抗体

CD40是肿瘤坏死因子受体家族的成分，在B淋巴细胞恶性肿瘤疾病，包括多发性骨髓瘤，有很高的表达，和天然配体（CD40L）结合能促进正常和恶性B细胞生长。CD40在初治的多发性骨髓瘤细胞上广泛表达，在进展期的多发性骨髓瘤细胞上高水平表达。CD40对骨髓瘤细胞的生长，耐药起着重要的作用：①对IL-6依赖的骨髓瘤细胞株ANBL-6的研究发现，CD40对骨髓瘤细胞IL-6的自分泌起重要的作用。②CD40能调节骨髓瘤细胞的黏附作用，使其黏附到骨髓基质细胞上，促进生长，生成和耐药。同样也能促进骨髓基质细胞分泌IL-6、血管内皮生长因子（VEGRF）、胰岛素样生长因子Ⅰ。③CD40和CD40L的作用通过激活PI3K／AKT／NF-kB信号而促进骨髓瘤细胞的迁移。

目前，抗CD40的单克隆抗体较少：有人鼠嵌合型的SGN-40和人源型的CHIR-12．12抗体2种。CHIR-12．12抗体能抑制CD40L介导的外周血淋巴细胞的增殖，而不干扰淋巴细胞的增殖；通过ADCC作用杀死CD40表达的淋巴瘤细胞。在体内外临床前试验中发现，CHIR-12．12抗体比抗CD20单克隆抗体具有更强的细胞毒作用。SGN-40同时还具有上调肿瘤坏死因子（TNF）家族配体，从而提高其细胞毒效应。

Tai等研究CHIR-12．12抗体对多发性骨髓瘤的细胞毒作用，发现CHIR-12．12抗体能结合到表达CD138阳性的骨髓瘤细胞株和原代骨髓瘤细胞上，抑制CD40L介导的骨髓瘤细胞的增殖，阻断CD40介导的AKT，IkBa，细胞外信号调节激酶的磷酸化，CHIR-12．12抗体特别能拮抗CD40介导的骨髓瘤细胞和基质细胞的IL-6和VEGF的分泌，CHIR-12．12抗体能干扰CD40L介导的骨髓瘤细胞与粘连蛋白和骨髓基质细胞的粘连，最后通过ADCC作用杀伤表达CD40的多发性骨髓瘤细胞。

Tai等在免疫调节药雷利度胺和抗CD40单克隆抗体（SGN-40）的联合应用的临床前研究中发现，先经雷利度胺预处理的骨髓瘤细胞（CD138＋CD40＋），易被SGN-40抗体溶解。体内研究发现主要是增加了表达CD16和LFA-1的 CD56＋CD3-的NK细胞的数量，雷利度胺能增加NK细胞的CD40L的表达，从而使抗CD40抗体大大增强了NK细胞对多发性骨髓瘤自身瘤细胞的杀伤溶解作用。Tai预言免疫调节药联合SGN-40将是治疗多发性骨髓瘤的新的治疗方案。

三、抗β2-微球蛋白单克隆抗体

β2-微球蛋白（β2M）是多发性骨髓瘤ISS分期的重要指标，β2-微球蛋白的水平影响多发性骨髓瘤患者的治疗疗效、总生存率，是多发性骨髓瘤预后的独立判断因素。

脂质筏的胞质侧富集了大量的细胞内信号分子，这些信号分子集聚形成信号分子复合体，使得受体的细胞内结构域很容易就与大量的细胞内信号分子发生相互作用，为信号的起始和交叉作用提供了1个结构平台。抗β2-微球蛋白单克隆抗体能使组织相容复合物-I（MHC-I）分子募集到脂质筏中，且能结合到β2M／MHC-I分子表面，激活Lyn和PLCγ2，从而激活c-Jun N末端激酶（JNK）上游激酶并使其磷酸化，ASK1，MLK3和MEKK1的磷酸化，进一步激活MKK4／7的磷酸化，最终激活JNK，而导致骨髓瘤细胞凋亡。MHC-I分子募集到脂质筏中，取代脂质筏gp130、IGF-IRβ和IRS-1，从而阻断了IL-6和IGF-I介导的JAK／STAT3，PI3K／Akt和Ras／Raf／ERK信号途径，因此抗β2-微球蛋白单克隆抗体抑制骨髓瘤细胞的PI3K／Akt和ERK信号途径，促进细胞的凋亡，增加骨髓瘤细胞对地塞米松的敏感性。

抗β2-微球蛋白单克隆抗体的抗肿瘤的机制，为将来临床应用治疗多发性骨髓瘤提供了强有力的支持。

四、抗成纤维生长因子受体3（FGFR3）单克隆抗体

15%～20%的多发性骨髓瘤患者具有t（4；14）（p16．3；q32）染色体异常，且FGFR3，MMSET表达水平较高。FGFR3的激活，通过MAPKs和PI3K的磷酸化途径，调节骨髓瘤细胞的生长，分化，迁移和成活。体外试验表明FGFR3表达提示临床耐药，而伴有染色体t（4；14）的患者生存期短。已有选择性的FGFR3酪胺酸激酶抑制药治疗多发性骨髓瘤。

Trudel等在体外证实用人源的抗FGFR3单克隆抗体（PRO-001）能选择性地有效地抑制FGFR3激酶活性；PRO-001能抑制t（4；14）染色体异常、表达WT-FGFR3的UTMC2多发性骨髓瘤细胞株的生长，但对表达突变型FGFR3的细胞株（KMS11，KMS18）无抑制作用，它的生长不依赖FGF配体；在小鼠肿瘤模型中研究发现，在注射PRO-001第3天即表现出与对照组的显著差别，连续4周的每天注射，肿瘤生长神奇般的减少了90%，且没有明显的毒性作用。伴有t（4；14）染色体异常并表达FGFR3的人多发性骨髓瘤患者的原代细胞，对PRO-001均很敏感，抗体能促进细胞凋亡。而对非t（4；14）染色体异常、不表达FGFR3的原代细胞无此作用。

从体外，体内的初步试验中发现，人源的抗FGFR单克隆抗体（PRO-001），对具有t（4；14）染色体异常，表达FGFR3的骨髓瘤细胞具有选择性的抑制作用，而且在动物实验中，其毒性作用轻。联合其他的细胞毒药物，或硼替佐米，雷利度胺等药物，或进行单克隆抗体的改造，连接一个特异的细胞毒药物可能获得更好的临床效果，这是将来研究的方向。

五、抗CD20单克隆抗体

CD20表达在B淋巴细胞的各个阶段，但分化进入浆细胞，CD20的表达就逐渐下调，有13%～22%多发性骨髓瘤患者浆细胞表达CD20抗原，且与骨髓瘤患者的较低的生存时间（13∶25个月）有关，预后差。有研究表明骨髓瘤细胞CD20表达与预后的相关的标记染色体t（11；14）异常有关，83%的CD20＋的骨髓瘤患者发现有t（11；14）的异常，浆细胞白血病患者有较高CD20的表达率（50%）。

临床前的研究表明：抗CD20单克隆抗体（Rituximab）能明显抑制CD138-／CD34-骨髓瘤细胞的生长，加入补体，能进一步抑制骨髓瘤细胞的集落形成。

临床上使用抗CD20抗体治疗多发性骨髓瘤患者只有少数报道。Moreau等应用抗CD20单克隆抗体治疗14例多发性骨髓瘤患者，其中初治7例，复发难治7例；所有患者均表达CD20抗原（范围：33%～100%），单药Rituximab　375mg／m2，每周1次，连续4周。结果：微小反应（MiR）1例，疾病稳定（SD）5例，疾病进展（PD）3例，无效5例。这是1组小样本的前瞻性的Ⅱ期临床试验，治疗的基础是骨髓瘤患者细胞表达CD20，但效果不理想。Hsi等报道Rituximab／＋MP方案治疗41例新诊断的多发性骨髓瘤患者，6例表达CD20抗原。单用Rituximab的仅16%患者获得MR和MiR，加MP方案的患者42%MR，25% MiR，28%SD，6%进展。Rituximab联合细胞毒药物（MP），明显提高了Rituximab的反应率，但其骨髓抑制比单用MP方案更常见。

（孟海涛　金　洁）