血痕的确证试验

一、血痕的确证试验

（一）血痕特异mRNA分子标记

近年来，有研究者使用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT－PCR）技术，发现在血痕中有多种特异表达的mRNA分子（表20－1）。2008年，ZUBAKOV等利用全基因组基因表达分析技术（whole-genome gene expression analysis），结合BioGPS数据库（http：∥biogos．gnf．org），又筛选出9种新的血痕特异mRNA分子标记，分别是CASP1，AMICA1，CAQR1，ALOX5AP，AQP9，C5R1，NCF2，MNDA，ARHGAP26等。它们主要在外周血淋巴细胞等有核细胞中表达。

表20－1　应用于血痕确证试验的主要mRNA分子标记

以往普遍认为mRNA在自然界中非常不稳定，容易被周围环境中无处不在的RNA酶所降解，很少研究mRNA分子标记在法医物证学中的应用。然而，现在的研究表明，mRNA分子在法医物证检验中有着明显的潜力。在保存时间达15个月的陈旧干燥血痕中，利用RT－PCR技术可以检测到SPTB和PBGD mRNA；而CASP1和AMICA1等9种分子标记则能在保存180 d的血痕中被检测到。其还有一个优点是，mRNA检测所需样本量比较少，如仅有6 ng左右的总RNA就能获得血痕确证试验的阳性结果。除了保存时间之外，一般来说，干燥、避光、密封保存的检材检出mRNA的阳性率高。

（二）血痕特异的miRNA分子标记

利用RT－PCR技术分析mRNA分子，扩增产物的长度为200～300 bp，要求RNA模板的完整性高。许多情况下，法医物证检材十分微量或高度腐败，难以达到这个要求。而另一类具有多种生物学功能的内源性非编码小分子RNA——microRNA（简称miRNA），其长度只有18～25个核苷酸，不易受检材腐败的影响，且在不同的组织中差异表达。通过分析miRNA差异表达谱，可识别不同的组织或体液。HANSON等采用芯片及RT－PCR技术分析了几种常见体液（包括血液、精液、唾液、阴道分泌液和月经血）中452种miRNA的表达情况，发现不同的体液有各自的miRNA差异表达谱，筛选出9种能有效区分不同体液的miRNA分子。另外，分析miRNA分子标记仅需总RNA 50 pg的样本，非常适合于法医检案实践。其不足之处是目前所发现的均为相对特异的miRNA分子，尚未发现只在一种体液中特异表达的miRNA分子。如血痕特异的miRNA标记（hsa-miR451和hsa-miR16）在精液和阴道液中也有少量的表达。因此，miRNA分子要应用于体液的确证试验尚需进一步寻找更特异的miRNA分子标记（包括组织和种属特异性），并通过大样本试验，建立数据分析的方法以及结果判定的标准（表20－2）。

表20－2　常见体液鉴定的主要miRNA分子标记

（三）抗人血型糖蛋白A（antiglycophorin A）免疫胶体金检测试纸法

胶体金法是一种免疫层析技术。胶体金颗粒自身呈红色，被抗体标记后则成为免疫胶体金。当免疫胶体金颗粒结合相应抗原后，再与抗原相应的抗体结合，免疫胶体金颗粒便被滞留而富集，出现肉眼可见的红色。目前常规用于血痕鉴定的胶体金法是抗人血红蛋白（anti-hemoglobin，Hb）胶体金试纸，它能同时解决血痕的确证试验和种属试验，其缺点是某些动物（如鼬、雪貂以及灵长类动物）的血痕会产生交叉反应而出现假阳性；另外当检测的血量过高（超过1 μL）时，会产生所谓的高剂量钩状效应（high dose hook effect）而产生假阴性结果。新近推出的另一种商品化胶体金试剂盒则用来检测人血中的血型糖蛋白A（glycophorin A），此种胶体金试纸法在检测鼬、雪貂、狗、猩猩、大猩猩、猿等12种动物血中均没有出现假阳性结果，具有良好的种属特异性，且当被检测的人血样增加至25 μL时，仍能观察到阳性结果而未出现钩状效应。