人工肝支持系统

人工肝的类型见表3－1。

表3－1　人工肝的类型

【物理型人工肝】

人工肝逐渐成为近年来EAISS的研究重点，但以解毒功能为主的物理型人工肝并未退出历史舞台。相反，随着材料与技术的不断进步，其血液净化效果不断提高，成为体外人工肝支持的重要方法，可单独或与生物型人工肝联合组成混合型生物人工肝用于肝衰竭的临床治疗。

1．血液透析　最早期的人工肝设计是基于这样一种假设；某些可透析物质可能在FHF患者肝性脑病的发生中起重要作用，对患者血液进行透析可以替代肝脏的解毒等功能。血液透析（hemodialysis，HD）的基本原理是基本膜平衡原理，即通过半透膜把血液与透析隔开，中、小分子物质借助浓度梯度在膜两侧弥散，从而达到清除血液中毒性物质的作用。当血液进入透析器时，血液中的代谢产物如尿素、肌肝、胍类、中分子物质和过多的水、电解质如钾等，可通过透析膜弥散到透析液中，而透析液中的物质如碳酸氢根或醋酸盐等也可弥散到血液中，达到清除体内代谢产物和纠正水、电解质及酸碱平衡紊乱的治疗目的。世界第一个人工肝装置便是由一台血液透析仪改装而成的，区别仅在于半透析材料与孔径等不同。

目前通用的聚丙烯晴膜分子截留量在15kD以内，尿素、氨、胆红素、肌肝及无机磷酸盐等中、小分子均可透过，但对大分子物质清除率低，故肝功能衰竭时复杂的大分子中间代谢产物及蛋白结合毒素难以被排出。基于能上能下原因HD较适于明显高氨血症患者，如侧支循环丰富的肝硬化患者摄入高蛋白饮食后由于食管静脉曲张破裂出血等诱发的肝昏迷，该类患者在透析后神志可获得一定改善；肝功能衰竭同时伴有肾功能衰竭患者可提高清醒率。更多的研究显示，HD仅能提高肝昏迷的清醒率，对其长期存活率却影响不大。鉴于传统透析膜较容易去除体内氨等亲脂性物质但不易去除脂肪酸、硫醇、酚等亲脂性物质，有人研制出亲脂性高流量聚砜膜透析器，该装置与聚丙烯晴膜透析器联合使用可迅速去除亲水性衰竭代谢产物。

由于透析膜材料的生物相容性尚不理想，故HD对患者凝血系统及血流动力学等方面有一定负面影响。为减少透析中发生意外的概率，以下情况应列为HD的相对禁忌证：①休克或低血压；②严重出血；③严重心脑并发症，如明显心脏增大伴心功能减退、脑出血等；④严重的心律失常。

2．血液滤过　血液滤过（hemofiltration，HF）是利用一种孔径更大的滤过膜，在跨膜压的作用下，4～5h内从体内均匀超滤出水分20～25L，同时依靠输液装置从滤器的动脉端或静脉端同步输入与细胞外液成分相仿的平衡液17～22L进入体内，借此使血液中的毒性物质经膜滤过而清除。HF是一个对流过程，血浆水分在跨膜压力差作用下通过滤过膜时，溶液中小于膜孔的溶质也随着血浆成分被动转移的量亦少；若每周有60～70升滤出液，其清除的中、小分子溶质量则相当可观，可达到既清除水分又清除溶质的目的。由于其置换液中缓冲碱可用碳酸氢盐代替，因此该方法是一种更接近于生理状态的血液净化疗法。由于超滤液中选择一定量氨基酸、蛋白质及其他有用的生物活性物质，故临床应用时要及时予以补充。有报道HF治疗5h可选择氨基酸4～6g，选择蛋白质1g左右。长期HF可选择一定量的激素如可的松、胰岛素等，此外尚可选择一定量体内必需的微量元素。

3．血液透析滤过　HF对中分子物质的清除优于HD，而对小分子物质的清除作用则逊于HD。血液透析滤过（hemodiafiltration HDF）是在血液透析的同时在透析液侧加负压并使用更大孔径的半透膜，使大于孔径的物质被抽吸入透析液中，故可兼取HD和HF的优点，使中、小分子毒性物质的清除效果更为理想。1986年Yoshiba等采用聚甲基两烯酸脂（PMMA）膜制成HDF装置，用其治疗1例暴发性肝功能衰竭（FHF）患者，结果患者意识状态恢复正常并长期存活。Hirasawa等的研究显示持续性血液透析滤过（continuous hemodiafiltraton，CHDF）治疗多器官功能衰竭（MOF）可降低炎性细胞因子等介质水平并改善组织供氧，同时亦有利于保持水、电解质及酸碱平衡。

近年CHDF多与血浆分离置换术（aphiresis）联合应用，以抵消血浆分离置换术所致高钠血症、代谢性碱中毒、胶体渗透压改变等副反应，并增加肝衰竭／肝昏迷时中分子物质的清除量。Yoshiba等采用血浆置换与HDF联合治疗67例FHF装置膜为PMMA与醋酸纤维素（CTA）制成，具有高通透性。结果65例（97．0%）曾恢复正常意识，55例（80．9%）经继续治疗后仍可保持清醒状态；7／7例（100%）甲型肝炎病毒（HAV）所致的暴发型肝炎及9／12例（75%）乙型肝炎病毒（HBV）感染引起暴发型肝炎得以存活；7／15例（46．7%）HBV携带者发展而成的暴发型肝炎及11／29例（37．9%）非甲非乙型肝炎病毒（NANB）所致的暴发型肝炎得以存活；总体存活率达55．2%（37／67）。作者还用同样方法治疗27例伴有昏迷的FHF，结果25例（92．6%）意识得以恢复，15例（55．6%）存活：该装置生物相容性好，存活者与示存活者在长时间治疗中均未出现并发症。Okamoto等采用血浆置换与PMMA膜CHDF治疗1例FHF患儿，结果在肝移植前成功地对该患儿支持了54天，病人意识状态明显好转。

4．血液灌流　血液／血浆灌流（hemperfusion，HP）是早期人工肝支持常用方法。该方法是将患者血液或血浆引入装有固态吸附剂的灌流器中，以清除某些外源性或内源性毒素，并将净化过和气血液／血浆回输入体内的一种治疗方法。目前常用的吸附材料是活性炭和树脂等，这些材料可吸附肝功能衰竭患者血液中的代谢毒素及尿毒素。早期活性炭灌流不良反应很大，随着微囊制备技术的迅速发展，应用微囊化活性炭进行血液灌流的方法逐步成熟，该方法不良反应明显减少，已在临床上发挥越来越大的作用。然而，活性炭微囊仍可引起肺梗死及出血倾向，分离出血浆，再经UPC活性炭不与血细胞接触，故不会影响血小板减少及炎性细胞因子的释放。新近Ryan等采用半乳糖胺（CalN）诱导的大鼠FHF模型（伴有Ⅲ度肝性脑病）研究了吸附剂血浆灌流的治疗作用。所用吸附剂包括活性炭、Plasorba（BR－350）树脂及特异性去除内毒素的吸附剂，多粘菌素B琼脂糖凝胶。研究内容包括：①治疗时机、治疗持续时间及治疗频率对动物存活率的影响；②治疗对肝细胞增殖及内毒素水平的影响。结果显示，治疗持续时间及治疗频率是影响血液净化效果的主要因素；治疗后肝组织内可见明显的肝细胞增殖；单独使用多粘菌素B琼脂糖凝胶进行血浆灌流可显著降低体内内毒素水平，作者认为，尽管生物型人工肝是目前研究的重点，但这种将非特异性与特异性吸附剂联合使用的吸附剂血浆灌流系统仍是一种简便有效的方法。

HP的最大缺点是吸附材料对吸附对象的选择较差，在去除体内毒性物质的同时，也吸附了白蛋白、肝细胞生长因子等一些对机体有用的物质；另外，虽然活性炭对酚、胍类及肌肝的清除率与HD相似，但对尿素、钠、钾、氯、磷、氢离子及水均无清除作用。近年一些具有相对特异性的吸附材料及吸附器正在研究之中，且已取得一定成果，如专门用于吸附内毒素及专门吸附胆红素的灌流器在研究中均显示了良好的吸附效果。但从总体上讲，虽然HP对肝功能衰竭患者脑病症状有明显改善作用，病死率却未见明显下降。

5．血液透析吸附　血液透析吸附（hemodiasorption，HDA）实际上是HD与HP结合的产物，可高效率、选择性地去除肝功能衰竭患者血液中的毒性代谢产物。其基本原理是将精制吸附剂制成悬液置于透析膜系统两侧，这样血液流经透析膜的同时也进行了毒物吸附，使血液净效率明显提高。新近Steszko等用高效液相色谱法（HPLC）研究了HAD治疗肝功能衰竭患者前后体内血浆氨基酸浓度变化，结果治疗后血中芳香氨基酸（AAA）含量明显下降。支／芳比上升90%；除支链氨基酸（BCAA）增加外，其他氨基酸如丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸及赖氨酸等水平亦明显增加；若HAD与血浆分离吸附技术相结合，其去除蛋白结合毒素及氨基酸的功能可进一步加强。有人认为多种氨基酸水平增加可能与干扰正常氨基酸代谢的毒素被去除有关。研究表明，在HAD系统的透析液中加入白蛋白可去除肝功能衰竭患者体内，与蛋白紧密结合的未结合胆红素清除能力的影响。作者将未结合胆红素加入牛血中作为循环液，所用滤过膜为聚丙烷砜（PAS）膜，结果显示透析液中白蛋白浓度为2g／dl组又显著提高，表明透析液中加入白蛋白可显著提高胆红素清除率。

HAD治疗的局限在于其生物相容性，尽管技术不断改进，其生物相容性问题仍远未解决。Kramer等对铜玢活性炭透析器的生物相容性进行了前瞻性随机对照研究。20例肝性脑病患者共分为两组，一组行传统保守治疗，另一组在此基础上行6hHAD治疗。结果治疗组体温、心率上升，血小板计数下降，3例在治疗过程中或治疗后不久发生出血，患者血浆弹性蛋白酶、肿瘤坏死因子α（TNFα）及白细胞介素6（1L－6）水平增高；而对照组未出现上述变化。作者的结论是，尽管HAD比传统活性炭HP在技术上做了较大改进，其生物相容性差的缺陷仍需从设计及抗凝措施等方面进一步改进。

近年来国外推出一种新型液透析吸附治疗系统Biologic－DT，其吸附液为精制粉末活性炭、阳离子交换剂、水、电解质、大分子溶剂及其他化合物组成的混合悬液，同时采用纤维素透析膜炭、阳离子交换剂、水、电解质、大分子溶剂及其他化合物组成的混合悬液，同时采用纤维透析膜将吸附剂与患者血液隔开，既简化有在较长时间内充分吸附毒物的同时，提高了血液净效率。美国加州大学的Wukjubson等进行了一项前瞻性随机对照研究观察Biologic－DT对FHF的治疗作用，结果治疗组预后好于对照组，治疗组在神经系统症状恢复及生物指征改善方面亦优于对照组。Ellis等对比研究了Biologic－DT治疗，6h／d共3d。结果显示3d后治疗组血氨低于对照组，患者血浆TNF、IL－8轻微增高，但血压、血小板计数、V因子、纤维蛋白及抗凝血酶Ⅲ均无明显变化，表明该系统生物相容性较好。Ash等研究了Biologic－DT对实验性狗肝功能衰竭模型的治疗作用。结果显示治疗组（n＝5）出现严重低血压、严重高乳酸血症及低血糖、肝细胞酶类在6h内明显增高。他们还用Biologic－DT治疗了15例伴高氨血症及肝昏迷的FHF患者，其中11例肝功能恢复而存活，4例成功过渡到肝移植；治疗期间患者舒张压及脉率保持平稳。然而Hughes等随机对照研究了Biologic－DT对FHF患者，5例为治疗组，共行18次Biologic－DT治疗，治疗过程中未用肝素抗凝；另5例为对照组。结果：治疗组血小板计数由（163±34）×109／L降至（101±13）×109／L，纤维蛋白原含量由0．53± 0．09g／L降至0．31±0．08g／L激活凝血酶时间（ACT）由190±17s增至223±22s，而对照组无上述变化；治疗结束时患者体内血氨等代谢产物并无明显下降。

最近，有人将血液透析吸附装置Biologic－DT系统与血液过滤吸附装置Biologic－PF相结合组成一种新型血液净化系统Biologic－HTPF。Steczko等研究了活性炭粉、硅粉及消胆胺作为Biologic－HTPF吸附剂对细胞因子及内毒素的吸附作用。结果：每克活性炭粉结合细胞因子（IL－1β、TNF－α）的功能为70～90ng每克硅粉可结合TNF－α13ng消胆胺在去除内毒素主面优于活性炭与硅粉；以活性炭作为吸附剂的Biologic－DTPF对细胞因子（TNF－α、IL－1β、IL－6）的清除率为12．6～23．4ml／min，胆红素清除率为17．8～34．7ml／min，肌肝清除率为AAA清除为120～160ml／min，未结合胆红素清除率为20～40ml／min，细胞因子清除率为15～25ml／min；将Biologic－DTPF用于治疗伴Ⅲ－Ⅳ度肝性脑病、呼吸功能不全及肾功能不全的严重FHF，患者血压及脑病症状得到改善，尿量保持稳定，血浆胆红素、AAA、氨、肌酐及IL－3明显降低，而未出现明显的血流动力学改变。作者认该系统在Biologic－DT基础上增加了去除胆红素及其他蛋白结合毒素的功能，故对严重肝功能衰竭及肝性脑病的救治有临床应用价值。

德国罗斯托克大学内科系两位博士Stange和Mitzner研制出另一种新型血液净化系统——分子吸附再循环系统（molecular absorbents recycling，MARS），该系统包含了透析与吸附装置，透析液中富含白蛋白，吸附剂为活性炭及阳离子交换树脂。MIRS可选择性地去除肝功能衰竭时体内堆积的蛋白结合毒素，还可清除苯二氮、硫醇及酚类等代谢产物，而对机体有用的物质与蛋白则不会损失。自1993年以来MARS已在欧洲及美国的53个中心治疗400余例患者，病种包括慢性肝功能衰竭急性发作、肝肾综合征、急性肝衰竭、肝移植后初期无功能及肝大部切除术后；患者耐受性好，未发生过严重不良反应；6～8h的MARS治疗可明显减少体内胆红素、胆汁酸、中短硅脂肪酸、AAA及氨；蛋白结合毒素清除率为10～60ml／min；治疗后肝性脑病程度减轻、平均动脉血压上升、肝功能好转，Stange等对MARS治疗的26例急、慢性肝功能衰竭伴肝内胆汁淤积（血胆红素浓度高于20mg／dl）患者进行了回顾性定群研究。结果单次治疗6～8h后，患者血中胆汁酸及胆红素水平比治疗前分别下降16%～53%和10%～90%；以患者血浆对大鼠原代肝细胞进行毒性试验，荧光显微镜观察证实治疗后血浆对大鼠肝细胞无损伤，而治疗前的高黄疸血则可造成大鼠肝细胞的明显损伤；肝功能Child－Turcotte－Pugh（CTP）评分治疗前趋于恶化者经2～14次治疗后明显改善；26例中共17例存活。肝功能衰竭时若发生肝肾综合征多提示预后不良，传统治疗效果差。Mitzner等进行了一项前瞻性对照研究，观察MARS联合治疗作为治疗组；两组病例在观察期间均未行肝移植、经颈静脉肝内门体分流术及使用血管加压素。结果：治疗组每日经6～8h治疗，经5．2±3．6次（1～10次）治疗后血中胆红素及肌酐水平显著下降，血钠水平及凝血酶原活动度明显增加，而对照组无此变化；对照组治疗第7天病死率为100%，而治疗组第7天与第30天病死率分别为62．5%和75%。Krey－mann等采用MARS治疗1例Wilson病所致FHF患者，病人为一18岁男性患者，伴有肝性脑病Ⅲ度、肾功能衰竭、溶血性贫血、横纹肌溶解、胰腺炎及血小板减少症；治疗中透析液白蛋白含量为44g／L，流速为1～2L／h。结果：前6次治疗共清除105mg铜，血铜水平降至正常；肝性脑病2d恢复，MOF得到控制；因病人起初拒绝移植，故此后又进行了35次MARS治疗，共清除43g胆红素及196mg铜；在59d治疗期间，MOF（特别是肝性脑病）未再出现；最后经患者同意而成功进行肝移植。作者认为MARS治疗Wilson病所致FHF可有效清除血胆红素及血铜，并可作为解毒措施治疗其他原因引起的FHF。

【中间型人工肝】

中间型人工肝包括血浆置换、同种异体交叉循环及异体肝体外灌流等，该类方法虽可补充生物活性物质，但无肝特异性功能，故从本质上是介于物理型人工肝与生物型人工肝之间的一类方法。目前，中间型人工肝可单独或与物理型人工肝、生物型人工肝组成混合型人工肝用于肝功能衰竭的临床治疗，也是肝功能衰竭非内科治疗的重要方法之一。

血浆置换（plasma exchange，PE）系将患者血液引入血浆分离器，分离并去除血浆以清除循环中自我体、异体抗体、可溶性免疫复合物如抗基底膜抗体等有害物质或蛋白的置换液混合后输入人体内。该方法清除的毒性物质不仅包括大分子物质，同时也包括中、小分子物质，因此对有害物质的清除范围远比HD为广，另外还可以补充肝功能不全病人缺乏的凝血因子、调理素、白蛋白等多种生物活动性质，适于肝功能衰病人的抢救与治疗。血浆置换可分为非选择血浆置换和选择性血浆置换两大类，后者可选择性地去除血浆中的病理成分，大大减少置换液量及治疗费用，因此应用较多。在PE的同时，加用血浆成分分离器（二次分离）对患者血浆做进一步处理，可进一步提高血液净化效率并减少置换血浆及白蛋白的用量。

早期血浆分离装置多采用离心分离装置，目前常用膜式分离装置。膜式血浆滤过器有空心纤维型和平板型两种，其中前者较为常用。整个血浆置换系统类似血液滤过装置，滤过膜系采用不同材料的合成膜，分子截流量亦有较大差别。国外常用多孔膜材料制成空心纤维管型血浆分离器，配有自动控制装置，并能平衡调节置换液与丢弃血浆的速度和比例，使患者的血容量和血流动力学保持稳定，且这种膜滤过式血浆分离器对血细胞损伤小，不会引起凝血机制障碍。

近年的研究显示，PE对各种原因所致的肝功能衰竭具有良好的治疗作用。Iwai等研究了PE对急性肝衰竭（ALF）患者血浆内毒素及炎性介质的清除作用。结果显示，PE后患者血浆内毒素水平迅速下降，肿瘤坏死因子α（TNFα）及白细胞介素6（IL－6）亦显著低于治疗前水平。

由于PE存在一定的不良反应，为减轻不良反应并增加疗效，与其他血液净化方法联合应用已成为近年来PE应用的发展趋势。PE的不良反应包括过敏反应、发热、低血压、高钠血症、低钙血症、代谢性碱中毒、低球蛋白血症、胶体渗透压改变、易诱发感染及肝素化引起的副作用等。PE与血液透析滤过（HDF）等联合应用可减轻其不良反应，并可增加肝功能衰竭／肝昏迷时中分子物质的清除量。Yorgin等将血浆分离置换术与持续性静脉－静脉血液滤过／血液透、滤过（CCCH／D）联合起来同步进行，称为P－CVCHD。该方法应用范围进一步拓宽，治疗时间进一步延长，不良反应较小，较单独应用血浆置换术有一定优势。1998年Ponikvar等联合应用PE、HD及高压氧（HBO）治疗1例体重16公斤、年龄为3岁4个月的ALF女性患儿。该患儿病原不明，伴有肝昏迷但有肾功能衰竭，1个月内共进行13次PE、13次HD及9次HBO治疗。前4次PE与HD先后进行，其余为两者同步进行；将370　20%白蛋白加入透析液中以增加胆红素清除量；治疗过程中少量应用肝素以防止凝血；PE及 HD的血液速度为80ml／min；HBO治疗为2．5大气压纯氧90min。整个治疗过程中患儿生理及精神状态良好，1个月后行肝移植而存活。

【生物型人工肝】

肝脏内富含600多种生物酶，具有复杂的代谢、生物转化、解毒及排泄等功能，肝功能衰竭将造成严重的代谢紊乱和毒物聚积，并常导致肝外其他脏器功能衰竭，形成MOF，因而病死率极高。理想的人工肝应具有活体肝脏的全部功能：①参与糖、蛋白质及脂肪三大物质的代谢；②清除毒物及中间代谢同产物；③生物合成与转化功能；④分泌具有促进肝细胞生长作用的活性物质。物理型人工肝主要以解毒功能为主，中间型人工肝解毒功能外尚可补充一些生物活性物质，但以上两种类型人工肝只能提供某一方面的肝功能支持，而不能全面替代肝功能。显然，物理型人工肝及中间型人工肝均不具备理想人工肝的特征。

新型生物人工肝的原理是将体外培养增殖的肝细胞置于体外循环装置（生物反应器）中，患者的血浆流过生物反应器时，通过容器内的纤维半透膜或直接与肝细胞之间进行的物质交换，从而达到人工肝支持的目的。因该型人工肝将肝细胞作为其生物成分，因而具有了理想人工肝的全部功能，是目前最有希望的EALSS方法。从构造上讲，生物型人工肝由反应器和细胞材料两大部分组成，前者为细胞成分提供生长、代谢场所，后者为整个系统提供特异代谢功能，两个部分相辅相成，缺一不可。

1．生物反应器　生物反应器是生物型人工肝的核心装置，其性能直接关系到人工支持的效果。它的主要功能是：①为肝细胞提供良好的生长代谢环境；②作为患者血液（血浆）与肝细胞相互作用、进行物质交换的场所。国外学者一直非常重视生物反应器的研究，相继提出多种设计思想与方案，使其性能不断改进。总体说来，目前的生物反应器可分为两大类：一类是纤维素半透膜微孔直径为0．2μm，白蛋白等一些小分子物质可顺利通过，而大分子物质则不能通过（分子截流量一般为6．5～200kD），使培养肝细胞与患者血液处于隔离状态，一方面可使肝细胞免受患者免疫系统的影响，另一方面可阻止肝细胞产生的异种蛋白进入患者血液循环，避免发生免疫反应。膜的分子截流量通常以Cut－off值计算，如50kD系指该膜能避免90%的50kD大小物质进行交换。一般采用Cut－off值50～100kD中空纤维管，以保证白蛋白（分子量为69kD）、凝血因子及小分子毒性物质的通过，同时又避免免疫球蛋白及补体（分子量通常大于100kD）的通过，以免激活免疫反应。

2．细胞材料　用于生物型人工肝的细胞材料包括肝实质细胞和肝非实质细胞（如内皮细胞、星状细胞等）。肝细胞作为生物人工肝的主要生物成分，在该系统中起着核心作用，该系统的支持作用主要来源于肝细胞的生物代谢功能，其支持效果与肝细胞的活性及代谢能力密切相关。鉴于细胞材料在生物型人工肝中的重要作用，其研究一直颇受国外学者的重视，并且正在取得迅速进展。

（1）肝细胞来源：用于生物人工肝的肝细胞包括同种肝细胞（人肝细胞）、异种肝细胞（哺乳动物肝细胞）和肝细胞株。从生物工程学角度看，用于生物人工肝的理想肝细胞应具有以下特征：a．人源性；b．表型正常；c．易于获得；d．易于培养且能迅速生长至高密度；e．能保良好分化状态数天至数周；f．具有成熟肝细胞的所有生物代谢功能。

①同种肝细胞：理论上，人肝细胞最为理想，但成人肝仅用于肝移植，因而成人肝细胞来源困难。为此有人提出将不适于肝移植的成人肝及肝移植时剩余的肝叶碎片收集起来，建立成人肝细胞“库”，以资利用，而其来源仍然有限。胎肝细胞特别是较大月龄胎肝分离出的肝细胞，可以体外继续分化增殖，且免疫原性弱，很少引起异性蛋白反应，若用于生物人工肝可望取得较好疗效，但基来源受限，也涉及伦理问题，因此难以推广应用。

②异种肝细胞：迄今为止国外一直使用猪、狗、兔、鼠等哺乳动物肝细胞，其中猪细胞是目前使用最多的细胞成分。Donato等测定了人肝细胞、猪肝细胞、狗肝细胞、兔肝细胞、大鼠肝细胞、肝癌细胞株等肝细胞最为接近，优于其他肝细胞，而肝癌细胞系的代谢能力非常有限。作者认为猪肝细胞适于替代人肝细胞作为生物人工肝的细胞成分。

③肝细胞株：无论是动物肝细胞还是人肝细胞，在体外培养时均存在生长条件要求严格、存活时间有限、不能增殖、传代困难等缺点，因而有些学者试图研究肝细胞株以弥补上述不足。由肝肿瘤细胞或正常肝细胞转化而来的肝细胞株具有正常肝细胞某些主要功能，且在体外培养时增殖能力强，可迅速达到人工肝支持所需的细胞数量。目前研究较多的肝细胞株主要有肝瘤细胞株HepC2、C3A，人肝细胞株HHY41、Hep Z，猪肝细胞株HepLin D63等。

（2）肝细胞分离：肝细胞分离方法对于所获肝细胞的产量、活性及代谢功能等均有重要影响。就猪肝细胞而言，体内分离法可获得高产量及高活性猪肝细胞，但此种方法的缺点是费时、费用昂贵、操作复杂且需要专门的外科器械。我们发展了一种简便易行、费用低廉、产率高及活性高的体外猪细胞分离方法，经全国推广应用，获良好评价。

（3）肝细胞培养

①培养方法：肝细胞培养方法对于生物人工肝的支持效果至关重要。新分离的肝细胞在悬液中由于缺乏立体支架很快丧失其活性及功能，不适于为肝功能衰竭患者提供较长时间的肝功能支持。经过十几年的努力，肝细胞的培养方法已有了重大进展，目前常用的培养方法主要有。球形体聚集培养和微载体培养。球形体聚集培养是用限制贴壁的方法如振荡、微重力培养及微囊培养技术等使新分离的肝细胞相互聚集，形成多细胞球形体，球形体内细胞的几何结构及细胞间连接等可使肝细胞的活性及代谢功能明显改善。采用微载体培养肝细胞，可通过立体支撑作用使肝细胞维护良好的形态特征，且可大大增加肝细胞附着的面积，增加细胞培养密度。球形体聚集肝细胞和微载体培养肝细胞均有很高的分化程度，有明显的分化增殖能力，能长期（50天）维护正常的生物学功能。因此是生物人工肝系统较为理想的细胞培养方法。鉴于微载体培养成本高，我科采用球形体聚集培养，达到了价廉和高效的目的。

②培养时间：生物人工肝支持系统中，肝细胞培养多长时间才能达到最佳支持效果尚不清楚。Flendrig等的研究显示，新分离的猪肝细胞可使大鼠肝缺血模型肝性脑病出现的时间明显延迟，血氨代谢显著改善，且肝细胞活性高，胞膜完整性好。

③细胞数量：生物人工肝达到理想支持效果所需的最低肝细胞数量目前仍不清楚。动物实验显示需10%～20%整肝量，由此推算一体重70kg的患者约需150g肝组织（1．5×109个肝细胞）。Watanabe等认为，由于肝功能衰竭患者肝组织内尚有部分残存肝细胞，故3%～5%整肝量［3～5×109个肝细胞］中可以起到较好的支持效果。至目前为止，文献报道在动物实验中使用的肝细胞数量为5．7×107－1．1×109个／kg（体重），在临床研究使用肝细胞数量为8．3×107－1．4×109个／kg（体重）。

（4）肝细胞冻存：将新分离的肝细胞进行冻存是长期保存肝细胞的经典技术，方法是将新分离的肝细胞制备成细胞悬液，而后分装于小瓶中进行冻存。该方法对细胞活性有较大损伤，原因是细胞膜的影响尤为突出，导致后续培养时肝细胞数量严重减少及特异性代谢功能严重受损。新近Koebe等尝试冻存肝细胞培养物以改善肝细胞冻存效果，方法是在冻存前将肝细胞进行适当培养以使肝细胞状态更趋稳定，然后置于组织培养瓶内进行冻存，取得良好效果。作者利用该方法将新分离猪肝细胞进行双层水凝胶夹心培养，第3天以速率控制法（RCF）将细胞培养物冻存，置－80℃3h（A组）及－80℃14d（B组），并设丙组对照：①未冻存肝细胞（NF）；②线性冷冻速率法（LFR）冻存的细胞培养物（C组）。解冻培养第2天，荧光显微镜观察显示RCF法（A组、B组）肝细胞存活率为75%±10%，冻存时间（3h、14d）不影响细胞存活率，而LFR法冻存的C组细胞存活率为10%± 5%；C组肝细胞LDH释放量明显增加；解冻培养48h RCF法肝细胞白蛋白合成及P450活性与非冻存细胞类似，显著高于LFR法肝细胞。为研究冻存肝细胞的实际疗效，Sarkis等将4m长中空纤维管（内置6×107个新鲜或微囊化冻存猪肝细胞）植入大鼠急性肝功能衰竭模型腹腔，结果病死率较对照组明显降低，且两治疗组病死率无显著差异；4d或4d后取出中空纤维，两组存活率保持不变；存活者肝脏明显再生，1个月后增至原有重量。作者认为微囊化冻存肝细胞与新鲜细胞同样有效。

（5）肝细胞永生化：肝细胞永生化建立肝细胞株是解决肝细胞来源的重要思路，已建立的肝细胞株在实验研究中大多取得了较满意的效果。但值得提出的是，由于安全性等原因，肝细胞株目前主要用于生物型人工肝的实验研究，仅C3A作为细胞成分用于生物人工肝的临床治疗，因此肝细胞株大量应用于临床治疗尚需时日。

①肝肿瘤细胞株：HepC2细胞株是从肝母细胞瘤分离出来的，具有肝细胞的代谢解毒功能并可在患者血浆中存活及生长，已作为肝细胞的替代物用于生物人工肝的实验研究中。C3A细胞株系人HepC2衍化而来，具有良好的分泌白蛋白、参与尿素及糖原合成等肝细胞特异性功能，且增殖能力强，在中空纤维生物反应器中接种2g细胞，可增殖到200g；将C3A用于治疗狗肝功能衰竭模型，获得良好疗效，并见人血清白蛋白、甲胎蛋白及凝血因子V增高；用其治疗7例Ⅲ－Ⅳ度肝性脑病患者，结果4例脑病症状改善，其中1例存活，其余3例因治疗前已有明显脑水肿，未见显著疗效。目前美国Hepatix公司生产的Hepatix ELAD体外人工肝辅助装置中使用的生物成分就是C3A细胞株。

②人肝细胞株：Kono等从人正常肝组织中分离肝细胞，经胶原凝胶夹心培养系统获得细胞株HHY41，该细胞株的获得既未用病毒转染，也未经致癌的处理。HHY41具有典型细胞的形态特征，细胞表面有肝细胞特异性抗原；具有葡萄糖－6－磷酸酶活性，能分泌白蛋白mRNA，细胞核型与正常肝细胞功能调控的良好模型，但尚未见将其用于生物人工肝的报道。Wemer等从肝活检标本中分离人肝细胞，经转染获得Hep Z细胞株。Hep Z具有细胞色素P450活性等肝细胞特异性代谢功能，能永久传代且增殖能力强，有明胶微载体法培养20d，细胞密度可达7．1×106个／ml，作者认为该细胞株适用于生物人工肝。

③猪肝细胞株：虽然原代猪肝细胞（PPH）与人肝细胞的代谢能力相似，但其在体外培养时寿命短，易丧失代谢功能，因而使其使用受限。最近Liu等用SV40病毒T抗原转染PPH获得一株非瘤源性、可无限传代且高度分化的猪肝细胞株HepLin D　63。该细胞株已连续培养传分散相2年余，其氨甲酰磷酸合成酶（尿素循环的关键酶）、细胞角蛋白18（PPH的特征性标志）、P450代谢活性、白蛋白合成能力等仍保持完好。将其接种于严重免疫缺陷的小鼠，未发生肿瘤，也无TAT（肿瘤标志）mRNA的表达。作者认为该细胞株为生物人工肝提供了有价值的工具。

④其他肝细胞株：谷胱甘肽合成酶（CS）是哺乳动物肝细胞清除氨的重要酶类。Enosawa等将CS基因导入无氨清除能力的HepC2细胞，，并使之培养于含CS抑制剂甲硫氨酸亚砜（MSX）的培养液中，获得MSX抗性HepC2，该细胞株具有一定氨清除能力。将其置于循环流式反应器共培养109d，培养3d后循环液中氨水平即有下降，培养结束时细胞数量从5×107增殖到5 ×109。作者认为基因重组肝细胞株可用于肝衰竭的长期及反复治疗。Kawashita等则研究了阳离子脂质体转染大批量猪肝细胞以行基因修饰并减少免疫反应的可能性，结果显示HVJ阳离子脂质体是一种安全有效的转基因工具，可用于生物型人工肝肝细胞材料的制备。

⑤回复肝细胞（reverted hepatocytes）：近几年来，国外学者设计了一种可回复性永生化程序（reversible immortalization），为解决细胞材料问题提供了新思路及手段。其基本原理是先将永生化基因SV40T基因，使细胞株复回到永生化前的状态，这样细胞既得到了增殖又不具有致癌性及病毒感染的可能性。日本学者Kobayashi等对原代成人肝细胞进行可逆性永生化程序，获得NKNT－3细胞株，具有肝实质细胞的形态学特征，可表达SV40T。经表达Cre重组酶的重组腺病毒转导，NKNT－3不再表达SV40T，且分化程度更高，核浆比及胞浆颗粒类似肝细胞。将回复前后两种肝细胞植入肝衰竭大鼠脾脏，结果两组存活率分别为40%和60%，两组均见肝脏形态和功能的显著改善，残余肝叶增大并示明显肝再生，脾脏“肝化”，尤以回复有细胞组显著。鉴于回复肝细胞无致瘤及致病毒感染之虑，在今后生物型人工肝及基因治疗中有良好应用前景。

（6）肝非实质细胞：迄今为止，生物型人工肝细胞材料的研究多以肝实质细胞为主，而肝非实质细胞如内皮细胞、星状细胞、成纤维细胞及Kupffer细胞等在生物型人工肝系统中的作用未受到足够的重视。鉴于肝非实质细胞也是肝系统中潜在价值近年来已逐渐引起注意，但总体说来文献仍然不多。Ries等研究证实肝非实质细胞与肝细胞进行混合培养可大大改善肝细胞活性及分化状态，有助于保持肝细胞特异性代谢功能。Mitaka等将从大鼠肝分离的小肝细胞、成熟肝细胞、肝内皮细胞、Kupffer细胞、窦内皮细胞及星状细胞等共同培养。结果显示，由于肝非实质细胞增加了细胞间连接及细胞外基质（ECM）沉积，小肝细胞形态逐渐由扁平状变为立体状，肝细胞特异性功能得以增强，表明混合培养可促进肝细胞进一步分化为成熟肝细胞；该项研究还显示肝非实质细胞的聚集有助于细胞间管状或囊状结构的形成。Michalopoulos等的研究证实，肝细胞与肝非实质细胞混合培养可促进肝细胞分化和增殖，电镜显示分化肝细胞的超微结构接近正常，增殖细胞核抗（PCNA）阳性率明显增加。

肝内皮细胞在肝窦内参与微血管形成，与肝内微循环的建立密切相关，同时还能分泌前列腺素，并对血浆中变性大分子具有吞噬作用。Kano等将内皮细胞进行体外培养，证实肝内皮细胞集落内易形成小管状结构，且肝内皮细胞在与其他肝非实质细胞共同培养时还可进一步分化肝细胞成熟肝细胞及胆管皮细胞。肝星状细胞存在于Disse间隙，星状细胞数量不多，但与肝内皮细胞及实质细胞的接触面广，1个星状细胞约与2～3个肝内细胞及20～40个肝实质细胞损伤后的再生和修复有重要作用，成纤维细胞对肝细胞的支持作用亦不容忽视。Bhatia等研究了肝细胞与成纤维细胞共同培养对肝细胞特异性功能的影响，结果显示与成纤维细胞相邻的肝细胞白蛋白合成及尿素生成等肝特异性功能明显高于远离成纤维的肝细胞。

3．治疗效果

（1）实验研究

①动物模型：目前常用的实验动物多为猪、狗、兔、大鼠及小鼠等，常用的模型有半乳糖胺或对乙酰氨基酚（扑热息痛）所致的药物性肝功能衰竭模型、通过外科手术制造的缺血性肝功能衰竭模型或无肝动物模型等，以上动物模型均有明显的肝衰竭症状及生化参数改变。

②实验效果：有关动物实验的报道较多，大多取得显著疗效。几乎所有的动物实验都证实，生物型人工肝能明显延长模型动物的生存时间，并使某些生化指标显著改善，有些实验结果还显示生物型人工肝治疗可促进体内残余肝组织的再生及功能恢复。如Patzer等中空纤维生物反应器与猪肝细胞构建的生物型人工肝治疗半乳糖胺诱导的狗肝功能衰竭模型，结果显示治疗组生存时间明显延长。Cion等用填充床式聚酯泡沫生物反应器与猪肝细胞组成的混合型生物型人工肝治疗缺血性狗肝功能衰竭模型，并观察血压、血氨、血糖、血清肌酐及其他肝功能参数的变化。结果：治疗组血氨、血清肌酐显著下降，而血压、血糖则显著升高。Nanruse等聚酯织物生物型人工肝治疗大鼠FHF模型时发现，不仅实验大鼠的存活时间延长、凝血系统参数及中心体温保持良好，而且其残余肝组织内肝细胞生长因子（HCF）呈阳性，参与调控肝细胞增殖的转不因子DNA结合率增加，肝特异性基因的表达增加，表明以肝细胞为基础的生物人工肝不仅可提供体外肝功能支持，而且还可促进残余肝组织的再生及肝特异性功能的表达。Guervas－Mons等研究了生物人工肝治疗对猪FHF模型肝功能的恢复的促进作用。反应装置由半透膜透析器与0．6×109同种异体冻存肝细胞组成，FHF模型制备方法为门体分流加70%肝切除及1h肝动脉血流阻断。41只猪肝衰竭出现24h后分为治疗组（n＝16）及对照组（n＝25），治疗方法为4h／d，对照组反应装置中无肝细胞；治疗前及治疗后4小时测颅内压。结果：肝衰竭出现后第15天，44治疗组动物肝功能恢复而存活，而对照组仅为22%；治疗组颅内压（n＝12）从13．13±5．1mmHg下降至7．19±2．06 mmHg，而对照组基本未变（分别为14．08±1．92mmHg和12．54±3．82mmHg）。表明生物人工肝治疗可促进肝功能的自发性恢复而增加动物存活率。Flendrig等观察了生物人工肝对猪肝缺血（LIS）模型的治疗作用，实验对象（平均体重约35kg）共分4组：①空白对照（n＝10），LIS后仅给予葡萄糖输注；②血浆置换对照（n＝8），LIS后给予血浆置换治疗；③无细胞成分生物型人工肝对照（n＝5），LIS后给予生物型人工肝治疗，但系统中无肝细胞；④生物型人工肝治疗组（n＝8），LIS治疗后给予生物型人工肝（含1．4×109个细胞）治疗24h。结果：治疗组存活时间51．1±3．4h，最长达63h；对照组存活时间仅为33．1±3h；胆红素及血氨水平显著降低；三对照组间疗效无差异；未出现严重不良反应。

③免疫反应：迄今为止，尚未见生物型人工肝在动物实验中发生严重免疫反应的报道。应用异种肝细胞而不发生明显免疫反应，可能与肝功能衰竭时机体免疫功能低下及反应装置中使用生物半透膜有关。目前较一致的看法是，异种动物间可通过肝细胞为细胞成分的生物人工肝相互提供体外肝功能支持。

（2）临床实践

①适应证：就目前文献看，混合型生物人工肝的适应证及可能适应证为：a．急性肝功能衰竭：一方面通过体外肝功能支持使患者能够在一定时间内存活，以等待合适的供肝；另一方面，通过治疗使患者代谢紊乱得以纠正，可提高肝移植的成功率；对于部分可逆性肝功能衰竭患者，通过支持治疗可使其获得较充分的时间和较合适的条件使肝细胞得以再生，从而避免肝移植；b．肝移植后初期无功能；肝移植后PNF的发生率为2%～4%，病死率高，通过生物人工肝支持治疗，部分患者可自行恢复，从而避免病情进一步恶化，不能恢复者通过治疗内环境得以稳定，为肝再移植创造条件，提高再移植的成功率；c．慢性病急生肝功能失代偿；部分病例通过治疗可使其肝功能恢复到治疗前状态，避免病情进一步恶化，不能恢复且适于肝移植者可通过生物人工肝过渡到肝移植；d．有助于行肝极量切除术；通过有效的体外肝功能支持可提高肝切除量，避免肝大量切除后发生急性肝功能衰竭，并促进手术后肝组织的再生；e．预防和治疗多脏器功能衰竭；急性肝功能衰竭常导致肝外脏器的功能衰竭，形成多脏器功能衰竭综合征，通过生物人工肝的代谢功能对MDS起到预防和治疗作用。

目前已有三种类型的生物型人工肝应用于临床治疗：a．生物型人工肝脏（bioartificial liver），由中空纤维反应装置与猪肝细胞构成，其商业化产品为美国Circe Biochemical公司生产的Hepat Assist2000；b．体外人工肝辅助装置（extracorporeal liver assist device，ELAD），由中空纤维反应装置与C3A肝细胞株构成，其商业化产品为美国Hepatix公司生产的Hepatix E－LAD；c．柏林体外肝支持系统（berlin extracorporeal liver support sstem，BELS），由编织型毛细管生物反应装置与猪肝细胞构成。

②治疗效果：虽然生物型人工肝尚未大量应用于临床，但从已有的报道看，治疗效果是令人鼓舞的，极大地提高了肝功能衰竭患者的存活率（这里的存活率包括通过生物人工肝治疗过渡到肝移植而存活以及经治疗后肝功有自发恢复而存活）。1987年Matsumura等首次将生物型人工肝应用于临床治疗，他们用兔肝细胞生物型人工肝治疗1例肝功能衰竭患者，结果发现治疗后血清胆红素下降，精神症状显著改善。1995年Demetriou等用猪肝生物型人工肝治疗10例经治疗后过渡到肝移植，2例在肝功能恢复后因其他原因死亡。1996年Chen等用猪肝细胞生物型人工治疗12例FHF和8例慢性肝病急性发作，12例FHF经生物型人工肝治疗后颅内压下降、脑灌流压上升、血糖升高、血氨及血清总胆红素下降，全部过渡到肝移植；8例慢性肝病急性发作者中2例适于肝移植者顺利过渡到肝移植，另外6例因符合肝移植指征而未行肝移植，先后于生物型人工肝末次治疗后1～14d死亡，所有8例病在生物型人工肝治疗后均见血氨及血清总胆红素下降。1997年Baquerizo等用猪肝细胞生物型人工肝治疗4例严重急性肝功能衰竭患者，结果3例成功过渡到肝移植，1例肝衰竭经治疗后肝功能恢复，避免了肝移植。1997年Watantbe等用Hep－atAssist2000治疗4例肝功能衰竭病人，3例成功过渡到肝移植，1例肝功能自行恢复，所有患者神经系统症状得以改善，治愈后未出现神经系统后遗症，未出现血流动力学副作用，同年Watan－abe等用猪肝细胞生物型人工肝治疗18例FHF和3例PNF，18例FHF中，16例过渡到肝移植，1例经治疗后肝功能恢复而未行肝移植，1例死于FHF并发胰腺炎，3例PNF均成功过渡到肝再移植。1997年Cerlach等用猪肝细胞BELS治疗1例45岁女性患者，该病人为药物性肝功能衰竭合并Ⅲ度肝性脑病患者，组织学检查证实肝细胞大片坏死，经治疗后患者血流动力学参数逐渐稳定，最后经肝移植而存活，未出现心肺及免疫学不良反应；到1998年为止，他们已用猪肝细胞BELS治疗急性肝功能衰竭6例，所有病人在治疗后血清胆红素下降，血流动力学稳定，均成功过渡到肝移植。Bismuth等用HepatAssist2000治疗8例FHF，7例过渡到肝移植（其中6例存活，1例有移植后因脑出血而死亡），1例行部分肝移植，7个月后因肝炎后再障继发感染而死亡。对乙酰氨基酚引起药物性FHF，结果3例成功能过渡到肝移植，5例经治疗后肝功能恢复，避免了肝移植；所有病人在人工肝治疗后神经系统症状及代谢紊乱情况得到显著改善，颅内压下降；治疗前后患者的心率、平均动脉压、心脏输出指数、中心静脉压、肺毛细血管楔压及明显的肝细胞再生证据。

最近，Kamohara等对比研究了生物人工肝与血浆置换对实验性猪FHF模型的疗效。作者通过阻断肝动脉血液建立FHF模型，实验共分三组：第一组（n＝6）不给任何治疗，第二组（n＝5）给予生物人工肝治疗，第三组（n＝5）给予血浆置换；治疗在肝动脉血流阻断的6h开始，持续4h。结果：与血浆置换相比，生物人工肝可显著改善FHF猪的肝功能，模型动物脑灌注压下降趋势得到控制，动物存活时间延长，一种纤溶抑制剂——纤溶酶原激活剂抑制因子1（RAI－）mRNA表达明显增强而凝血酶原时间（PT）却无明显缩短，表明模型动物出血症状得到控制是由于PAI－1合成增多而非PR改善所致。Sheil等将肝细胞培养于生物反应器并与透析装置相连组成一种新型生物人工肝支持系统，称为肝生物透析系统（LBDS）。作者用LBDS治疗1例猪肝衰竭模型，结果：治疗过程（30±3小时）中肝细胞保持了良好的活性，肝与血液透析相连有助于防止免疫反应的发生并可使装置的代谢功能进一步加强与完善。

③安全性：从目前研究看，生物型人工肝不仅疗效满意，而且对患者血流动力学稳定性无不良反应，未发现免疫反应及其他不良反应，但仍有几个问题值得考虑：a．免疫反应：短期应用异种肝细胞生物型人工肝尚未见发生免疫反应的报道，但长期反复应用是否会发生免疫反应有待进一步观察。Baquerizo等研究发现，患者经2次以上猪肝细胞生物型人工肝治疗以后，体内出现异种抗体，但病人未出现免疫反应，该抗体对后来施行的同种异体肝移植也无不良影响。b．临床应用猪肝细胞等哺乳动物肝细胞有传播人兽共患病的可能性。c．肝细胞株：C3A等肝细胞由肝肿瘤细胞转化而来，用于临床治疗其安全性仍需进一步研究。d．装置的生物相容性：若使用生物相容性差的材料必然会对患者凝血系统及补体系统造成不良影响。Huges等研究了ELAD治疗对患者细胞因子系统、凝血系统、补体系统（TNFα）、白细胞介素6（IL－6）水平无明显升高，但48h后降至治疗前水平，IFNγ治疗前后无明显变化：C反应蛋白（CPR）、凝血酶抗凝血酶Ⅲ复合物（TATⅢ）在灌流24h后有所升高，但无统计学意义；以上结果显示生物人工肝治疗可致细胞因子升高及凝血系统、补体系统激活，其原因可能为血液与人工肝治疗导致细胞因子升高及凝血系统、补充系统激活，其原因可能为血液与人工生物膜接触所致，但这些反应较轻微且持续时间短，未对患者造成严重影响，若采用生物相容性好的膜材料，可以降低此反应。

猪内生反转录病毒（PERV）基因组存在于所有猪细胞中，体外实验证实PERV可感染人体细胞。Nyberg等对生物型人工肝中采用的中空纤维是否能阻止PERV跨膜传播进行了研究。作者使用了三种中空纤维装置（HFCs）：①纤维素膜中空纤维装置，额定分子截流量（MWCF）70kD；②聚砜膜中空纤维装置，额定MWCF400kD；③混合性纤维素膜中空纤维装置，孔径200nm。猪肾细胞株PK15细胞（可产生PERV）培养于HFC管内腔，在14d的培养期间内收集管腔内液及管腔外液标本，用反转录PCR检测PERV，阳性标本以人293细胞检测PERV的感染性。结果：所有孔隙为200nm的纤维管外腔标本PERV呈阳性，MWCF为400kD有70kD的纤维可使其管外腔标本PERV阳性时间延迟3d与7d；MWCF为400kD及70kD的纤维管外腔液标本对人293细胞不具有感染性。作者的结论是纤维膜孔隙、膜组成成分及暴露时间是影响PERV跨膜传播的主要因素。Pitkin等28例行体外生物型人工肝治疗的肝功能衰竭患者进行了回顾性研究，以评价PERV的感染性。治疗采用的装置为HepatAssist，细胞成分为猪肝细胞。PCR法证实所有患者在生物型人工肝治疗5年后外周血单核细胞（PBMC）PERV阴性，并证实半透膜使PERV跨膜传播的危险系数降低，猪肝细胞与人细胞系293共同培养未产生感染性PERV。以上结果不支持猪肝细胞生物型人工肝治疗存在PERV感染可能性的论点。