管碟法影响因素的控制

用管碟法测定抗生素的效价，是国内外常用的方法，也是生物测定中最准确、最简便的方法。但是由于其原理是以扩散为基础的，所以只要是能影响扩散的因素，就能影响测定结果的准确性。从动力学方程式可以看出抑菌圈的大小受扩散系数、扩散时间、抗生素的总量、培养液的厚度及最低抑菌浓度等因素的影响。在检测中应控制这些因素的影响。另一方面，本检测方法又是以抗生素浓度与抑菌圈直径呈直线关系的平行线原理而设计的，因此对影响直线的斜率、截距及直线平行性的诸因素也必须加以控制，方可保证检验结果的准确可靠。

（一）直线斜率的控制

斜率小，即抗生素浓度差异小，而抑菌圈的直径差异大，灵敏度准确性高，由动力学公式可知：1／9．21DT为直线斜率，故斜率决定于D、T。如D、T不变时，则斜率恒定，即各直线互为平行。如扩散快，即D值大，则斜率就小；如试验菌生长慢，时间长，T值就大，则斜率亦小。斜率小生物反应灵敏度高。某些试验菌生长迅速，如蜡样芽孢杆菌，可通过控制培养液营养成分或降低其pH，或降低温度等措施促其生长延缓。如使备妥菌层双碟预先冷却，再滴加抗生素溶液；或滴加抗生素溶液后，先在室温预扩散，再置温箱中培养等，这些都可使T或D值增大，使斜率变小。当扩散系数D不变时，T值变小，即试验菌生长速度快，斜率增大，这样灵敏度降低，重现性也差。因此采用快速测定效价时，其误差＞一般常规测定法。在一般试验条件下扩散系数D值变化不大，但如培养液中盐量、琼脂量、加菌量、温度等变化均会影响D值改变，从而影响斜率。

（二）直线截距的控制

直线截距决定于C、D、T、H诸因素，其中D、T值一般相当稳定，所以，C、H值是决定截距的主要因素。如将培养液厚度H减小，截距也随之减小，抑菌圈增大。据此可设计薄层培养液，可大大提高检验的灵敏度。此法可用于食品或血液中含微量抗生素的测定。同时试验菌敏感度C对截距影响较大，而C常受接种量、培养液成分、pH及温度影响而变化，试验中亦须注意。

（三）抑菌圈大小的控制

抑菌圈的大小受L、H、C、D、T及A等诸因素的影响。抗生素总量M＝CV＝CAL（A为管底面积、H为高度、V为管内体积、C为抗生素浓度）的影响：从（1）式看r2＝4DT［lnM－lnC－ln（4πDTH）］，可见抗生素浓度是影响抑菌圈大小的，若C不变，则r2随V而变化，那么L或A均影响抑菌圈大小。因此抗生素浓度应准确，包括称量、稀释均应准确，稀释用的仪器、容器均应标准。同时要注意小钢管的规格应一致，内外壁光洁，两端平齐光滑，壁厚薄均匀一致，切面应圆整。适时恰当地放置小钢管，防止放置小钢管时重力不一致；加入小钢管内的药液要与小钢管内的高度齐平。双碟、刻度吸管等要防止污染和残留微量抗生素等。

培养液的厚度H、试验菌敏感度C、扩散时间T及扩散系数D的影响：H增大，r缩小；C减小，r增大。C常受加菌量及其对抗生素耐药性等因素的影响而有所改变，从而影响r大小。T受细菌生长快慢的影响而引起r改变。D扩散快慢亦可使r改变。因此应注意选用敏感性的试验菌并保持其不变异，特别要防止染菌，制备菌层时含菌浓度要适宜。向小钢管内滴加标准溶液和供试溶液时要交叉进行，以免偏向。培养箱温度要恒定，否则均会影响T值。滴定操作台要水平，双碟底要平坦，底层和菌层一定要铺平，尤其是菌层，否则影响H值。培养液中琼脂量、盐类等都影响D值，这些因素的变化又影响r的大小。

（四）剂量反应直线范围控制

直线范围在下列情况下会缩短：管径小、装量少；浓度低；因培养液或试验菌吸附或破坏抗生素等因素使小钢管中抗生素量下降，导致直线范围缩短，常使呈弧形。为此可用调整缓冲液的pH，使抗生素稳定；调整培养液pH；调整培养液的处方及除去杂质；选用更为敏感的试验菌加以控制。同时在抑菌圈形成过程中，温度发生变化，影响T值，使斜率变化，直线范围亦可因之缩短。

（五）抑菌圈圆整及清晰度的控制

抑菌圈常有破裂不圆，甚至无圈现象。这些情况的产生主要是由于向小钢管加抗生素溶液时有溅出或漏出；有时也可能因双碟或小钢管残留或污染有抗生素而造成的。如果污染杂菌或因菌层培养液温度过高，试验菌被烫死，均会使抑菌圈不圆整或破裂。有的抗生素如新霉素A、链霉素等会因抗生素中含的盐类浓度太高或pH太低而形成卵形等形态，甚至无圈。

在某些情况下出现抑菌圈边缘模糊、类似锯齿状或呈双圈等现象，主要由下列因素所引起：

（1）当试验菌培养物不纯，含有一同敏感度的几种菌株，如菌种中含耐药性菌，使C含有C′、C″、C等差异，类似锯齿状或呈双圈等现象，主要由下列因素同敏感度的几种菌株，如菌种中杂有耐药性菌，致使扩散系数紊乱。其次菌种中有不同生长时间的菌体，以致有不同的T值，这些都能使抑菌圈边缘不清晰。

（2）抗生素的培养液内扩散系数不一如混有几种类型的抗生素、抗生素受缓冲液或受培养液内的杂质影响或使其形成某种化合物，致使抗生素浓度总量发生变化。因此，对培养液的原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及琼脂等的选用极为重要。这些都可影响抑菌圈的大小和清晰度。

（3）小钢管内的抗生素浓度不断下降；当试验菌能吸附或破坏抗生素时，就更为严重，此时可出现双圈现象。

（4）不适当地延长培养时间，由于某些抗生素的抑菌圈边缘的菌群只是被抑制，当延长培养时限后，菌量增加，使抗生素敏感度降低，抑菌圈边缘菌群继续繁殖，导致抑菌圈变小或边缘模糊不整齐，如测定制真菌素时，培养时间过长，其抑菌圈边缘就不清晰或不整齐。要控制培养时限，使抗生素在培养液内的浓度，恰能抑制试验菌，而在抑菌圈边缘的浓度能刺激试验菌的生长，就能形成清晰的抑菌圈。

此外，对抗生素标准品和供试品同质的要求至为重要。因为效价测定设计假定二者剂量反应直线是相互平行的，如不平行或斜率不等，那么计算结果就必然发生较大误差。不平行性除操作影响外，无论是标准品中或供试品中若有其他抗菌性物质或影响抗菌活性的物质（加强或拮抗），均可使二者剂量反应直线不平行，对此必须注意。如供试品四环素制剂中含有维生素C时，在标准品中也应加入相应量的维生素C，以保持标准品与供试品的同质性，这样检验结果才是可行的，也才能准确。

（六）操作技术的注意事项

（1）由于抗生素效价测定管碟法是微量的微生物分析法，故称量除应满足用容量及仪器进行定量分析的一般要求外，还应注意效价测定试验室内防止抗生素污染。效价测定滴加钢管的操作室内，地面、水平操作台、钢管放置器、钢管，以及各种玻璃器皿等，都要避免被抗生素污染。即使有微量抗生素的污染，往往使试验结果混乱。在配制培养液或缓冲液时，亦应严防被抗生素污染。

（2）操作次序安排上的误差：在一剂量法制备校正曲线时，双碟数量较多，滴加抗生素溶液至钢管的时间，各个双碟的时间应基本一致。如滴加8组稀释度双碟，可从中心浓度组开始向高、低二端交叉滴加。如稀释度为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7及C8，滴加次序可C4、C5、C3、C6、C2、C7、C1及C8。这样，可减小各组间抗生素扩散时间及试验菌生长时间的差异。尤以枯草杆菌在室温较高时，这种影响更为明显。此外，标准品与供试品的称量，应在相近的时间内称取，稀释后的溶液尽量在相同的条件下放置，并使放置的时间也相似，以减少误差。

滴加双碟小钢管的次序所致的误差，受操作者的熟练程度的影响，而且在方法设计上也是无法抵消的。因此，要求滴加迅速，如一组三个双碟18个小钢管的滴加时间，控制在1min以内较好。在操作很多检品时，以分批操作为好，切勿同时放置几排双碟先滴好标准品溶液后滴加各批供试品溶液，这样使标准品与供试品溶液的扩散时间和细菌生长时间带来差异，引致误差。

（3）测量抑菌圈应避免误差：测量抑菌圈是本法取得试验结果的重要环节，目前多已采用抑菌圈面积测量仪，此测量仪克服了使用游标卡尺容易产生的主观误差。