效价检测方法

微生物比浊法效价检测有二剂量法及校正曲线法两种试验设计，前者设计较为合理而精密，对试验结果进行统计分析，可估计试验的误差；后者设计不够对称，精密度差，试验结果亦不易估计误差。

（一）二剂量法的试验设计

微生物比浊法效价检测方法的试验设计，除一般的微生物检测要求外，还有以下基本要点。

1．基本要点

（1）培养条件的控制：在培养过程中，培养用大试管必须规格一致、质地相同（最好用同一牌号、同一批号的产品）；恒温水温箱的水温要求均匀，可在水浴两端安装电动搅拌机各一台，连续搅拌，使温度均匀。各批样品的对照管与样品管，在水浴中放置位置完全按正交拉丁方排列。

（2）细菌生长误差的控制：接种细菌后的培养液，分装至各管前，宜用冰水冷却，在培养终结时，应将各管同时自恒温水温箱中取出后，也应立即冷却，然后再在各管中，加入12%甲醛液各1ml。

（3）测量时间的控制：测量吸收度时，各管应先充分振摇，将菌液移入吸收池内后，再静置2～3min（一般用2min）读数。

（4）吸收池的位置：吸收池应有记号，每次测定吸收度时，方向应相同，吸收池的位置，宜放在离光检测器远端。

（5）培养液、缓冲液、菌液、灭菌生理盐水、稀释样品用蒸馏水、试验培养中的菌液，以及各种稀释用玻璃仪器、吸收池等，都必须尽量防止被毛点、纤毛等污染。

2．二剂量法的操作及误差统计分析

（1）标准品溶液及供试品溶液的制备：可按各品种的具体规定，稀释制备。

（2）比浊法试验用培养液的接种：接种试验菌的量，需作预测试验，使S1、S2管，经培养后（37℃，一般4h），吸收度A（D光密度）在0．3～0．5为适当。

（3）标准品溶液及供试品溶液的分装：取备妥的大试管16支，分配dS14支，dS24支，dT14支及dT24支，分别作好标记。将标准品溶液dS1、dS2及供试品溶液dT1、dT2各1ml按批号加入相应的大试管中。注意：加入溶液时，均在有标记处沿管壁移入，以便在分装培养液时，可沿此处管壁流入，将抗生素充分洗入培养液内。

（4）分装：比浊试验用的培养液，接种试验菌后经冷却，用移液管或其他分装器，分装至大试管中，每管20ml，此分装量每管务求一致，其差异愈小则试验的精密度愈高。注意：主要为各管一致，而不需绝对量正确。移入培养液时，按加入样品溶液的标记处稍上方，沿管壁流入，立即振摇，使抗生素溶液与培养液混合均匀。

（5）培养：各大试管在培养过程中，不用棉塞，宜用铝盖或用25ml小烧杯（内衬滤纸片一张）覆盖。在37℃培养4h。

（6）培养终结及杀菌：培养终结时，应将各大试管同时取出，立即置冷水浴中冷却在各大试管内加入12%甲醛液1ml立即振摇。注意：加入量务求各大试管一致。

（7）测量：取未经接种的比浊试验用培养液20ml，加蒸馏水1ml，12%甲醛液1ml摇匀，作为空白，在适当的分光光度计上，波长530nm处，测量各大试管内培养物的吸收度。每管在测量前应充分振摇，使管底的菌沉淀物全部摇散均匀，移入吸收池内，并用此培养物冲洗吸收池3次，然后再用擦镜头纸擦净吸收池外壁，置仪器吸收池架上，放置2或3min，读取吸收度。

（8）计算结果及误差统计分析：比浊法效价测定二剂量法结果的计算，可照管碟法效价测定二剂量法结果的计算式计算，亦可用误差统计分析方法（无碟间差异），求出效价、可信限及可信限率，以检验试验结果的可靠性。

（二）校正曲线法

共用15管培养液，每一个剂量浓度用3管，每一样品用3管培养液。其他操作技术均与二剂量法相同。

1．效价的计算　求出各剂量点的吸收度的平均值，取单周半对数坐标纸，将吸收度用算术刻度，剂量浓度用对数刻度，标出5点位置，连成校正曲线，也可用下式计算得最高最低吸收度值，两点直接绘成校正曲线。

L＝（3a十2b＋c－e）／5

H＝（3e十2d＋c－a）／5

式中：L为校正曲线最低浓度的计算吸收度值；H为校正曲线最高浓度的计算吸收度值；a、b、c、d、e为校正曲线自低剂量至高剂量，依次各浓度的平均吸收度值。

2．样品效价　计算样品管吸收度的平均值，自校正曲线上，求得抗生素的含量，再乘以样品的稀释度，即得样品中抗生素的含量。