岛津高效液相色谱仪标准操作规程

［目的］　建立岛津10ATvp高效液相色谱仪常规操作步骤。

［适用范围］　岛津10ATvp高效液相色谱仪常规操作。

［规程］

1.过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

2.排尽色谱液路内气体，打开HPLC工作站（包括计算机和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

3.双击计算机桌面class-vp　5.02快捷方式，进入HPLC控制界面主菜单，选择Instrument　1。

4.先用甲醇和水依次冲洗泵和进样阀。冲洗泵时，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀时，在进样阀的load和inject位置反复冲洗。

5.打开计算机页面method窗口，单击Instrument setup，设置流速及流速变化时间，从小流速开始冲洗，流速越大，压力越大，一般不要超过2　000psi。观察基线及压力的情况，待压力及基线稳定后，方可进样检测。

6.设计进样方法。点击open method，选取现有的各种进样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀、泵、检测器等。确定流速、梯度变化时间及流动相组成，编制time program，保存新建方法。

7.进样和进样后操作。选定进样方法，输入样品名及保存路径，点击single run，可实时监测样品运行情况。所有的样品均需过滤。全部样品走完后，再用水和甲醇依次冲洗色谱系统，洗掉系统内残余物。

8.关机时，先关计算机，再关液相色谱。

9.填写登记本，由负责人签字。

10.注意事项

（1）流动相均需色谱纯，水用millipore超纯水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

（2）所有流经色谱柱的液体均需严格的过滤。

（3）压力不能太大，最好不要超过2　000psi。

［参考依据］　岛津10ATvp高效液相色谱仪使用、维护手册。

［附件］

1.液相色谱仪的保养。

2.液相色谱柱使用及维护。

3.HPLC六通阀进样器的使用及保养。

附件1

液相色谱仪的保养

1.HPLC的日常操作条件　温度：10～30℃；相对湿度＜80%；最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。

2.泵的保养

（1）流动相尽量要清洁，使用前过滤、脱气。

（2）进液处的沙芯过滤头要经常超声清洗。

（3）流动相交换时要防止沉淀。

（4）避免泵内堵塞或有气泡。

3.进样器的保养　每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。

4.色谱柱的保养

（1）柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。

（2）当柱子和色谱仪联接时，阀件或管路一定要清洗干净。

（3）避免使用高黏度的溶剂作为流动相。

（4）进样样品要过滤，保证没有沉淀。

（5）严格控制进样量，根据试验需要及不同色谱柱的载样量而定。

（6）每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱。

（7）若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。

5.紫外检测器（UV）的保养

（1）紫外灯的保养：在分析前、色谱柱基本平衡时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。

（2）样品池可用5%硝酸溶液，1ml／min流速，冲洗1h，最后再用水冲至近中性即可。

附件2

液相色谱柱使用及维护

新的色谱柱在使用之前应该在自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。

1.平衡色谱柱

（1）反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在一定比例的乙腈溶剂中的。一定要确保所使用的流动相和乙腈溶剂互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中，溶剂可能会挥发，因此在用流动相分析样品之前，应使用10～20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水“过渡”。

（2）硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡。

（3）平衡过程中，将流速缓慢地提高。

（4）用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂纯度如果较低，则需要较长的时间来平衡）。

2.色谱柱的再生　进行色谱柱再生时，应使用一个廉价的泵，最好不使用高效液相色谱仪上的泵见下表。

建议用来冲洗的溶剂体积

根据下列内容选择合适的再生方法：

极性固定相（如Si，NH2，DIOL基色谱填料）的再生

正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水

非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生

水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水

注意：在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1mol／L（0.1M）的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。如果简单的有机溶剂或水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05mol／L稀硫酸冲洗非常有效。

3.色谱柱的维护

（1）使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相或离子性流动相中有一定的溶解度）。（2）大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围。

（3）避免流动相组成及极性的剧烈变化。

（4）流动相使用前必须经脱气和过滤处理。

（5）如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中。

（6）压力升高是需要更换预柱的信号。

附件3

HPLC六通阀进样器的使用及保养

六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。

1.工作原理

（1）手柄位进样（Load）位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；

（2）将手柄转动至进样（Inject）位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。

2.六通阀进样器的使用及保养事宜

（1）手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。

（2）六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75%，如20μl的定量环最多进样15μl的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3～5倍，即20μl的定量环最少进样60～100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100μl的平头进样针配合20μl满环进样。

（3）可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10μl的定量环，实际是9μl还是11μl并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。

（4）进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0.45μm的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其他残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。