其他辅助检测

4．4．1　聚合酶链反应

核酸检测是一种鉴定腺病毒快速而有效的方法，即使基因组含量很低或灭活病毒也可以检测到。目前对腺病毒的核酸检测主要采用聚合酶链反应（PCR）方法。腺病毒为双链DNA无包膜病毒，常规方法是提取标本中病毒DNA作为模板，采用普通PCR或实时PCR等检测病毒核。实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号进行实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时PCR中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR的进行，PCR荧光定量反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。与普通PCR相比，实时荧光定量PCR具有更简便、更灵敏、更快速等优点，已广泛应用于病原微生物的检测，在腺病毒检测中也得到应用。

4．4．2　核酸分子杂交

核酸分子杂交技术是在1968年由华盛顿卡内基学院的Roy Britten及其同事发明的，其原理是具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测，而腺病毒的检测方法为以一段与腺病毒DNA互补的核苷酸序列单链作为基因探针，以放射性或非放射性标志物进行标记，可采用Southern印迹杂交、夹心杂交（三明治杂交）、斑点杂交及原位杂交等方法进行核酸分子杂交。

Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法，基本操作过程如下：腺病毒基因组DNA用限制性内切核酸酶酶切后，用琼脂糖凝胶电泳，碱变性，将酶解片段转移至硝酸纤维素膜上，加入杂交液和标记探针进行固相杂交，然后洗涤膜，去除多余探针，最后于X线片上放射自显影，根据基因探针与待测DNA限制酶酶切片段杂交的带谱，可以直接确定病毒的存在状态，同时可分析是否与宿主基因发生整合。

夹心杂交是Dunn在1977年首次介绍的，由Ranki在1983年进一步改善完成，是一种主要应用于微生物检测的分子生物学方法。夹心杂交用两个探针，即捕获探针和信号探针，两个探针分别用不同的标志物标记（如生物素、地高辛等）。检测时，首先将探针固定于载体上，然后加入待检测样品的核酸提取物或者细胞裂解液；洗去未杂交的样品核酸，再加入信号探针，最后显色检验。用于标记的物质包括荧光分子、特殊酶类和放射性元素等。其中捕获探针的载体可以是塑料分析板，可以是96微孔板，也可以是磁珠。

斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting）是在Southern印迹杂交基础上发展出来的快速检测特定核酸分子的杂交技术。由于在试验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵，一次可做大批量样品的筛选，同时还可半定量反映样品中的病毒含量。

原位杂交是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，它用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。原位杂交可检测石蜡切片、冷冻切片和细胞培养标本等。该技术可检出细胞中单拷贝mRNA，估算病毒在宿主细胞中复制和转录的程度，对于病毒感染（特别是具有长潜伏期的病毒感染）的诊断和研究很有用。

小测试

问：中和试验鉴定检测腺病毒方法的原理是什么？

答：中和试验是病毒血清学试验中常用的一种抗原－抗体反应，用以测定人或动物血清中和抗原抑制病毒感染的生物效应，是反映机体抗特定病毒感染能力最可靠的方法。中和抗体是指能与病毒结合并使之失去感染力的抗体，主要是IgG。特异性的抗病毒免疫血清（中和抗体）与病毒作用，能够破坏病毒表面的受体作用点，抑制病毒对敏感宿主的吸附、穿入和脱壳，从而阻止病毒的繁殖，使病毒失去感染能力。