从定义上看，冷冻保存就是将生物组织在冷冻温度下保持在暂停生命的存活状态。在–196℃时，所有的化学反应、生物进程以及细胞内外的生理活动都暂时终止。在0～25℃温度下，细胞的酶活性降低，不过活性仍然保持。当温度降至-40℃以下时，细胞不再进行理化交换。如果需要长时间保存，温度必须保存在-130℃以下。当细胞经历从37℃骤降到-196℃时，细胞内的水分可丢失95%以上，导致细胞内的电解质浓缩。细胞内的冰晶形成可使细胞变形受压，甚至导致细胞破坏。
因此，在制订方便实用的冷冻草案时需要考虑细胞脱水、机械压力及细胞内结晶化的问题。冷冻速度也是个重要的变量，因为细胞在缓慢冷冻时，细胞外基质空间的水流增加，而在快速冷冻时，水的渗透相对较慢。针对这一复杂问题，人们应用冷冻保护材料在冷冻过程中对细胞加以保护。二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）可以保护细胞内蛋白质特别是质膜细胞免于变性。目前公认的高浓度的二甲基亚砜等冷冻保护剂可以减轻造成细胞死亡的成核现象和结晶堆积成像，然而其高浓度也会通过直接毒性反应引起细胞损伤。这一风险可以通过缩短细胞在室温下与冷冻保护剂接触的时间来规避。
目前为止，人们对脂肪组织的冷冻储存研究不多。有研究记录了脂肪组织在家用冰箱-18℃中储存2周后，将其注射到裸鼠体内发现脂肪组织的成活率和未经冷冻的对照组相类似。最近人们应用了一种简单的冷冻方法，将脂肪组织储存在液氮中长达8天时间后冷冻组织中的代谢活性保存完好。令人称奇的是，在上述两项实验中，脂肪组织在冷冻时都未加入冷冻保护剂。然而，值得一提的是，脂肪组织是间充质干细胞的源泉，而后者在再生医学中发挥重要的生物作用。因此，我们应该考虑只分离储存脂肪衍生的基质血管碎片。实际上，已经有大量的研究报道了基质血管碎片的分离、生长和分化。目前的所有应用脂肪衍生间充质干细胞的临床试验都是建立在基质血管碎片基础上的。如上所述，脂肪衍生的间充质干细胞是多能干细胞，它们能形成各种组织，例如骨、肌腱、软骨、心脏和神经等，它们为现代的细胞疗法敞开了一道大门。尽管目前脂肪衍生间充质干细胞只是被用作自体细胞应用，但可能在不远的将来，经过一定工艺技术后，每个人的需求都将能得到满足。
高级细胞治疗产品应用的另一个主要障碍就是法律问题。欧洲和瑞士的监管机构正在发展新的标准以调控这一迅猛发展的崭新领域。Swissmedic，瑞士的监管机构已经明确地制定出与之相关的相应法规。实质上，与脂肪衍生基质血管碎片相关的所有程序都必须严格遵循GMP原则进行，即组织的运输、分离以及细胞冻存都必须在清洁房间内进行。生产为患者应用的高级细胞治疗产品都必须在清洁房间或者细胞工厂内进行操作。其基本原理是因为如果将高级细胞治疗产品考虑为药品，那么其生产就应该按照药品的生产标准。而且，2007年以来，高级细胞治疗产品实际上已经被当作了药品。从储存角度来看，其冷冻程序也应该在GMP标准下执行。因此，最后的液氮储存也应该符合GMP的标准。起始程序的细胞工厂以及产品在进入机构进行处理前都必须经检验证明符合各项标准。
我们为此设计并检验了从吸脂术获得的脂肪组织中提取和冷冻基质血管碎片干细胞的操作程序。在此过程中，我们实施了以下步骤进行评估：
（1）基质血管碎片定性分析。
（2）冷冻程序和储存。
（3）细胞解冻和定性分析。
下面我们描述了这些步骤的实际操作和结果，并且对基质血管碎片衍生干细胞是否具有成为高级细胞治疗产品的潜能进行了最终评估。
1.基本血管碎片定性分析 我们将50g吸脂所得脂肪组织置于无菌注射器中，用来收集和运输脂肪抽吸物样品。在无菌条件下，用不含钙镁离子的无菌磷酸盐缓冲液洗涤脂肪，即时从3个脂肪样品中分离基质血管碎片。应用胶原酶混合液在37℃下将清洗后的脂肪组织消化30分钟，然后再用磷酸盐缓冲液清洗样品。脂肪分层后，将亲水层部分收集在50ml无菌管中。将消化后的样品在15℃，400g下离心5分钟，细胞小球（基于血管碎片）再由磷酸盐缓冲液清洗两次。将基质血管碎片重新悬浮在5%的人清蛋白溶液中。在样品冷冻前，分析如下参量：
①每克组织中的细胞数目；②集落形成能力，即总细胞量中集落形成的数量（%）。
图8-6显示的是细胞在培养7天后，集落形成的情况。计数细胞和形成的集落，并计算集落形成率。
2.冷冻程序和储存 基质血管碎片计数后，我们把细胞按照固定数目冷冻（表8-1）。将基质血管碎片重新悬浮后，在无菌条件下存于4℃，缓慢加入二甲基亚砜（2.5ml/25ml冷冻袋），然后在-80℃过夜储存。最后将冷冻袋转移至气态液氮罐储存2天。
图8-6 供克隆计数的CFU-F培养皿图片。附表展示了每克组织提取的细胞数和克隆计数
3.细胞解冻和定性分析 消融时，将细胞冷冻袋迅速放入37℃水浴锅内3～5分钟，重新悬浮细胞后，再进行培养，以行进一步的定性分析。应用台盼蓝排除染色计数解冻后的活性细胞。由于确认间充质干细胞最主要的标准就是观察细胞是否附壁于塑料壁，因此我们将这些细胞接种于有盖培养皿中。表8-1列选了3个样本的分析结果。
综上所述，我们以往的经验证明了基质血管碎片可以在冷冻细胞的标准条件下冷冻。经过该操作之后的细胞活性和其他冷冻细胞相比未见异常，因此可以在生物银行中安全应用。当然，我们还需要对这些实验结果进行进一步研究，我们也正在积极地验证其他更多的脂肪组织样本，不过从我们的实验室中建立总结出来的标准化方案，包括脂肪组织的量（50～110g）、分离草案、冷冻和解融草案已经证明，脂肪衍生的间充质干细胞可以和其他众多的细胞类型一样，作为再生医学中一个极富价值的细胞来源，可以在扩充增殖后用于先进的细胞治疗。
表8-1 来自3个SVF样本细胞的冷冻/复苏结果
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