在概念验证实例研究中，我们在不同质地和表面化学性状的生物材料上对细胞的吸附、增殖和分化进行评估，以检验表面化学和地形学在引导细胞行为上的作用。这个研究的目的是强调材质选择和模块化组合设计的重要性，而不是推销特定的材料。我们将两种人造材料和一种自然衍生材料：聚交酯（polylactide，PL）微球、明胶微球和聚苯乙烯平面细胞培养器材表面一起进行检查比较。聚苯乙烯是2-D细胞培养的传统材料，因此用作理想的对照材料。聚交酯已经为人们广泛研究，这种材料具有可调节的生化特性，FDA已经通过了它们在人类医药领域中的特殊应用。明胶通常作为细胞的支持结构而被广泛应用，并可以用来在体外繁殖软骨细胞。
明胶和聚交酯微球制备好后，后者利用油水乳化过程在随后的酒精中水解。将小鼠3T3-L1前脂肪细胞以3×105/100µl的密度种植在三种材料的支架上。在第4天将含有地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的分化培养基加入半数的培养孔中，将另一半保持在无诱导因子状态。所有标本培养18天。
扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）的结果显示在培养的第18天，细胞沉积在聚交酯和明胶微球上（图9-2），不过在两种材料上显示了明显不同的表面拓扑现象。差示扫描量热法结果表明经聚乳酸是无定形的。被水解的微球和残留在培养基中的微球没有统一的溶解温度，但有一个溶解范围：115～190℃。水解和培养支架的结晶百分比为（1.24±0.02）%～（2.12±0.06）%。凝胶渗透色谱分析的结果表明聚交酯微球应用基的平均分子量在水解后减少，在培养18天后其下降更加明显（图9-3）。该结果强调了一个重大信息：聚交酯的性质很容易被人为地改变，结晶度和（或）分子重量的轻微变化就会对细胞行为有着深刻的影响。
在培养媒介里乳酸和葡萄糖的积累增加表明细胞新陈代谢活跃。第2天和第18天时，所有支架或者培养器材表面的细胞乳酸测量有明显不同，葡萄糖测量的结果也是这样。
图9-2 培养18天后，聚交酯（PL）和明胶（gelatin）微珠表面的扫描电镜（SEM）影像图片（左×400；右×400）
图9-3 聚交酯（PL）支架的平均分子量
DI表示分化培养液。*代表在干燥PL（0天）和接收细胞的PL以及水解支架间存在统计学上的差异（P＜0.05）；#代表在干燥PL（0天）和培养18天后支架之间存在统计学上的差异（P＜0.05）。误差条代表标准误差
组织学检查的结果表明，种植在聚交酯微球上的细胞在第4天时还没有在微球表面形成融合层，然而此时，明胶微球已经完全被细胞包围，它们生长在微球表面的各个层次。第18天，在缺少分化诱导剂的情况下培养在聚交酯微球上的细胞出现在微球表面，但后者似乎已开始脱落。在分化培养基中种植在聚交酯微球上的细胞，并没有在这时附着在微球上。而种植在明胶微球上的细胞，无论有没有分化培养基，均在第18天时仍均附着在支架上，并且还长入到支架的微孔中。与此相反，活体/离体图像表明无论是聚交酯还是明胶微粒，在培养的第4天细胞几乎完全覆盖其上。在缺少分化诱导剂的情况下，种植在聚交酯微球上的细胞数目，在第18天似乎比第4天少。在培养的第18天，死亡细胞数目明显增加。在分化培养基中，第18天聚交酯微球上死亡细胞数目同样增加。两种培养基中，种植在明胶微球上的细胞几乎全部成活，而且没有出现细胞脱落现象。组织学和显微镜学检查结果的不同有可能归因于组织学检查过程中的过度处理。
种植在聚苯乙烯对照板上的细胞经油红O染色后显示细胞中含有脂类。在第4天，明显可见少量脂质（图9-4），但在第18天，种植在没有分化诱导剂培养皿中的细胞，大约有1%被脂质覆盖，但在分化培养基中，大约有18%的培养皿表面被脂质覆盖（图9-4）。
图9-4 油红O染色结果。在无分化诱导因子的培养液2D表面培养4天（A）、18天（B）以及在分化诱导培养液中培养18天后的改变（C）（×32）
该研究结果和其他相关研究都强烈建议，虽然化学效应离不开空间效应（2D对3D培养），但是，在相似的化学条件下，2D培养系统得到的结果跟3D培养系统得到的结果完全不同。因此，若想成功预测细胞的在体行为，就必须设计出相应的体外生物材料。在分化培养基里，明胶微球上培养的细胞比其他细胞群分泌更多三酰甘油。在第18天，有分化诱导剂参与的种植在明胶微球上的细胞产生（142.5±16.3）μmol/L三酰甘油，而种植在二维平面分化培养基里的细胞产生（39.0±26.5）μmol/L三酰甘油，种植在聚交酯微球分化培养基里的细胞产生（29.8±20.9）μmol/L三酰甘油。种植在分化培养基里明胶支架上的细胞产生的三酰甘油的浓度，与种植在分化培养基里聚交酯微球和二维平面上的细胞产生三酰甘油的浓度明显不同（P＜0.05）。这一结果强调了在界定细胞路径方面生物材料理化规格的重要性。在组织学上，聚交酯微球上附着低密度的细胞，很像一个加工中的工艺品。然而，很难通过成像观察到在细胞和聚交酯微球之间的脆弱界面。
应用Pico Green方法分析可见，在实验开始时，每个含有微球的孔中种植有大约300000个细胞。但在第4天，每个微球上只剩下不到150000个细胞，说明不到一半的细胞附着在微球表面。这一结果表明，附着的细胞在18天培养周期里数目有所增加。统计学分析显示，在有或没有分化诱导剂的情况下，明胶微球上种植的细胞数目跟在同样的培养条件下聚交酯微球上附着的细胞数目完全不同（P＜0.05）。
逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase，RT-PCR）可用来检测细胞种植在3D支架上后表达aP-2的时间点，以及在这个时间点上前体脂肪细胞和（或）脂肪细胞额外的基因表达。选择前体脂肪细胞诱导物用的是小鼠生长抑制剂或DNA损伤诱导蛋白153（GADD153）。脂肪细胞诱导物用的是小鼠过氧物酶体增殖因子激活受体γ（PPAR-γ）和小鼠脂肪细胞特有的脂肪酸结合蛋白2。小鼠肌动蛋白作为对照基因。半定量结果是由柯达凝胶成像系统拍摄的谱带强度决定的。将每个样本的光谱强度与相应的β-肌动蛋白谱带强度进行标准化处理，可以获得基因表达的相关水平。
RT-PCR的结果表明，没有分化诱导剂参与的情况下，聚交酯微球上的细胞群落在培养第10天表达肌动蛋白和DNA损伤诱导蛋白153。在分化培养基中聚交酯微球上种植的细胞表达为DNA损伤诱导蛋白153、β-肌动蛋白、过氧物酶体增殖因子激活受体γ和脂肪酸结合蛋白2。在第18天，没有分化诱导剂参与的情况下，种植在聚交酯微球上的细胞表达为DNA损伤诱导蛋白153，脂肪酸结合蛋白2和β-肌动蛋白。在同一时间点，种植在分化培养基中的细胞表达为β-肌动蛋白、过氧物酶体增殖因子激活受体γ和脂肪酸结合蛋白2。无论有无分化诱导剂参与，种植在明胶微球上的细胞都表达DNA损伤诱导蛋白153、β-肌动蛋白、过氧物酶体增殖因子激活受体γ和脂肪酸结合蛋白2，这是在培养第10天时，表达的所有基因。在不添加分化诱导剂的情况下种植在聚苯乙烯上的细胞在第10天表达DNA损伤诱导蛋白153、β-肌动蛋白和过氧物酶体增殖因子激活受体γ，而种植在分化培养皿中的细胞在第10天表达全部4种基因。第18天，在没有分化诱导剂参与的情况下，种植在聚苯乙烯上的细胞表达为DNA损伤诱导蛋白153、β-肌动蛋白、过氧物酶体增殖因子激活受体γ，但还是不能表达为脂肪酸结合蛋白2。
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