生物分子和脂肪组织衍生干细胞

生物分子是指那些维持组织工程结构的完整性，并调节它们组成成分的生物材料。生物分子的主要组成包含以下细胞要素：生长、分化、血管生成、促进炎症反应和基因调节。用于不同组织工程结构的特定因子可以通过外源性或局部或全身的传递途径供给。脂肪组织在内分泌生理方面是一个动力“运动员”，可以作为细胞因子分泌的源泉。在临床上，已被证实肥胖患者具有较高的促炎细胞因子水平，如白细胞介素（interleukin，IL）6、白细胞介素-8和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）。而且，脂肪组织表达造血生长因子和巨噬细胞刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF），这些因子可以导致脂肪组织体积的增大。

脂肪组织衍生干细胞为多能细胞，具有分化能力，可以通过多种途径对生长因子和环境因素做出反应。有证据表明脂肪组织衍生干细胞可以通过传递和局部分泌炎性因子促进组织恢复，近期的活体研究也支持这一假说。在小鼠的局部缺血损伤实验中，静脉输注脂肪组织衍生干细胞可以促进肢体功能的恢复。脂肪组织衍生干细胞对局部缺血发挥的积极作用与它分泌血管生成细胞因子（如肝细胞生长因子和血管内皮生长因子）的功能相比，只是小巫见大巫。

笔者在本章回顾了脂肪组织衍生干细胞的分泌功能和细胞因子谱，重点阐明其基本作用原理以及脂肪组织衍生干细胞和细胞因子、肥胖因子或者其他生物分子之间的相互作用。

（一）血管生成因子

1.肝细胞生长因子（HGF）　将脂肪组织衍生干细胞种植在缺血性心肌组织中以增加血管生成的方法，目前已成为一种新的治疗手段。大部分临床研究用的都是骨髓细胞，而骨髓细胞数量有限，不容易分离。很多资料支持脂肪组织衍生干细胞分泌肝细胞生长因子，这说明在心血管疾病的细胞治疗方面脂肪组织衍生干细胞可以作为一种潜在的细胞来源。离体研究显示脂肪组织衍生干细胞来源的肝细胞生长因子同机体的生理或病理状态之间存在一定的因果关系。已证实脂肪组织衍生干细胞分泌的肝细胞生长因子，可通过血管内皮细胞对小血管的生成有积极作用。这种作用并不依赖于血管内皮细胞生长因子的存在。遗憾的是，Rahimi等发现脂肪组织衍生干细胞分泌的肝细胞生长因子可以促进乳腺肿瘤上皮细胞的增殖。Kilroy等报道，在体外脂肪组织衍生干细胞可以通过自身分泌或诱导分泌肝细胞生长因子。笔者认为，这个性能依靠于脂肪组织衍生干细胞的分化水平。需要注意的是，向脂肪细胞分化的脂肪组织衍生干细胞似乎失去了对碱性成纤维细胞生长因子的反应性，同时失去了对肝细胞生长因子表达的诱导作用。另一方面，用β-成纤维细胞生长因子或是肝细胞生长因子处理未分化的脂肪组织衍生干细胞时，肝细胞生长因子释放水平增高。最后，添加维生素C似乎可以增加之前已经增高的肝细胞生长因子分泌，增值在2倍或2倍以上（图10-1）。

图10-1　肝细胞生长因子（HGF）的分泌

条件培养液中的HGF分泌由ELISA测定。这些条件培养液包括无分化（A、C）和脂肪细胞分化（B、D）培养液。经表皮生长因子（EGF）（A、B）或者基础成纤维细胞（bFGF）（C、D）处理后的ADSC在无（白色柱图）、添加（实心柱图）不同浓度2-抗坏血酸时的HGF分泌情况

Rehman等也有类似的报道，人类脂肪组织衍生干细胞分泌的肝细胞生长因子数量庞大[（12 280±2944）pg/106个细胞]。为了评估其在体的潜在生存能力和功能，笔者用表达GFP的腺病毒转导脂肪组织衍生干细胞，以追踪其在小鼠四肢的位置。注射后1周，（28±2）%的注射细胞可通过肌肉序列切片识别。

2.血管内皮生长因子（VEGF）　血管内皮生长因子一般在胚胎发育阶段、组织损伤后、运动后和局部缺血时促进新生血管形成，从而在血液循环不充足的情况下向组织中释放氧分。血管内皮生长因子是生长因子特别是血小板源生长因子家族里磺胺酸生长因子的子系。它们是重要的信号蛋白，在血管发生和血管生成中发挥作用。已经有人报道，骨髓干细胞可以分泌血管内皮生长因子。Rehman等证明脂肪组织衍生干细胞也是血管内皮生长因子的来源之一。笔者曾经报道，将脂肪组织衍生干细胞在含5%的小牛胚胎血清、常氧条件、无添加生长因子的基础培养基里培养72小时后，细胞可以分泌大量的血管内皮生长因子[（1203±254）pg/106个细胞）]。有趣的是，当脂肪组织衍生干细胞在缺氧条件下培养时，分泌的血管内皮生长因子可增加5倍，从（1203±254）pg/106个细胞增加到（5980±1066）pg/106个细胞。脂肪组织衍生干细胞对缺氧等刺激的反应特性表明，它们可以通过增加分泌血管内皮生长因子来应对局部缺血，诱导新生血管形成，从而适应所处的病理环境（例如心肌局部缺血）。

（二）造血和促炎性因子

骨髓衍生的间叶细胞可以提供长期的造血支持，这是其最具有临床相关性的特性之一。跟骨髓衍生的基质细胞相比，脂肪组织衍生干细胞也具有相似的扩充造血细胞的能力。为了评估它们的造血分化能力，Kilroy等用纯化的CD34p Linneg细胞对脂肪组织衍生干细胞进行长期的培养分析，在3周或5周后检测培养中是否仍有克隆形成骨髓细胞（clonogenic myeloid cells，CFC）的存在。虽然造血细胞在培养3周后就会出现，在第5周却仅有少量具有克隆形成能力的祖细胞存在。这些初步试验的结果表明脂肪组织衍生干细胞可以在离体的情况下特别是短期培养时维持造血作用。为了直接对比脂肪组织衍生干细胞和骨髓衍生干细胞的造血能力，上述作者随后进行了长期的培养分析。结果表明，骨髓衍生的基质细胞可以为原始祖细胞提供更多有效的支持。虽然脂肪组织衍生干细胞不如骨髓细胞强大，但也显示了真正的造血能力。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是骨髓基质细胞产生细胞因子的兴奋剂，当笔者将脂肪组织衍生干细胞与脂多糖处理时，发现其分泌白细胞介素-6和白细胞介素-8的水平增加。特别值得一提的是，当在脂多糖中处理24小时以后，条件培养基中的白细胞介素-6和白细胞介素-8均达到了最高水平，平均分别为7845pg/ml和6506pg/ml。同样，造血细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）在24小时后达到了最高水平，平均分别为976pg/ml和52pg/ml。然而，在脂多糖中处理8小时后，肿瘤坏死因子α就达到了峰值112pg/ml。白细胞介素-7和促炎性细胞因子白细胞介素-11的值较低。ELISA分析明确显示了它们的产生，并在24小时达到高峰，平均分别为3.4pg/ml和12.7pg/ml（图10-2）

图10-2　促炎因子和造血细胞因子的分泌情况

经分析，在经脂多糖（LPS）（100ng/ml）处理24小时后的未分化ADSC条件培养液中选择性细胞因子的分泌如图。A．IL-6（实心柱图），IL-8（白色柱图）；B．M-CSF；C．GM-CSF（白色柱图）和TNF（实心柱图）；D．IL-7（白色柱图）和IL-11（实心柱图）。数值以mean±SEM表示，来自6～8 个ADSC供体；E．应用PCR从一个具有代表性的供体ADSC，分析细胞经LPS处理0小时或4小时后，选择性细胞因子的mRNA 分泌水平

与ELISAs的结果相一致，RT-PCR检验发现，在脂多糖作用4小时后，上述细胞因子相对应的mRNA水平也相应提高。未分化脂肪组织衍生干细胞在脂多糖处理后，在条件培养基中未发现白细胞介素-1a，白细胞介素-1b和白细胞介素-12蛋白。该研究的数据表明，脂肪组织衍生干细胞对高剂量化疗患者术后的造血干细胞移植有临床应用价值。最后，我们可以把脂肪组织衍生干细胞与造血干细胞结合输注来促进正常血细胞的恢复，重建免疫功能。

表10-1介绍了在脂肪组织工程中可能应用的生物分子。

表10-1　当前在脂肪组织工程中可用的生物分子