应用脂肪组织衍生干细胞进行骨再生

当骨折发生时，不仅破坏了骨的钙磷结晶体结构，而且破坏了骨的有机基质，即骨折周围的血管和软组织。发生骨折的外力及骨折产生的骨碎片会进入周围的组织，破坏血管、筋膜、肌肉和邻近的组织，从而触发一系列信号转导。这些系统和局部信号是通过神经冲动、骨折局部的血肿、骨折周围组织的损伤等介导的。这些信号相互影响相互转化，可分为两类：炎性信号（如IL-1、IL-6和TNF-α）和骨重建再生信号（骨形态发生蛋白、生长因子和WNTs）。这些信号支配着吞噬细胞向骨折部位迁移并在此处清除坏死组织。而且，这些信号可以促使新生血管向骨折部位内部生长、提供营养、招募细胞、促进骨祖细胞的增殖，直到新骨形成。细胞招募分化的过程称为骨诱导，而生成新骨的过程称为骨生成。骨诱导时必须有一个供新骨再生的支架。支架必须与断裂骨的断端密切贴合并保证该贴合的稳定牢固，否则骨折很难愈合。

生成新骨组织替代损伤骨需要骨先质细胞的参与。这些细胞可穿过骨折部位的骨膜或通过血管进入血肿。特定机制和某些生物学刺激，如骨诱导等可促使间充质干细胞分化为成骨细胞。然而，这种迁移不能满足所有骨折愈合的需要。例如，较大或严重的骨折，实验研究称之为“临界骨缺损”，即缺损的骨长度超过骨直径的2倍，这时骨先质细胞的自然迁移不足以完成骨愈合。另外，如前所述，年老或有疾病的患者也不能完成自身骨愈合。因此在这些情况下，就需要应用体外移植物促进骨愈合。最佳的移植模具是应用基质作为支架以供骨形成、应用细胞以重建骨质及应用诱导性生长因子的结合物，后者包括骨诱导、骨传导和骨生成的生长因子。骨移植的黄金标准是应用最常用的髂骨嵴骨片移植至骨折区。不过该手术的创伤较大，骨的供区有限，因此寻找其他造骨细胞来源，以及可供这些细胞形成新骨的人造支架可谓势在必行。

已经证明脂肪组织衍生干细胞可以在体外培养和动物模型中生成骨组织。细胞需要在体外培养2～4周，应用与骨髓中提取的间充质干细胞成骨分化时使用的相同培养基和培养环境。当在培养基中加入地塞米松和b-甘油磷酸盐时，脂肪组织衍生干细胞就表现出成骨细胞的基因特征，如骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-4和甲状旁腺素（parathyroid hormone，PTH）受体1。几周后，这些细胞形成矿化基质。已证明在培养基中添加骨形态发生蛋白-2，生长和分化因子5（growth and differentiation factor-5，GDF-5），可增加细胞的成骨潜能。这些细胞的成骨特性可通过如下方法检测：通过细胞表面的标志物矿化组织的形成（组织学检查）或者通过碱性磷酸酶的分泌。对于脂肪组织衍生干细胞与骨髓干细胞之间的比较，各家言论不一；一些学者认为两种细胞能力相同，其他学者认为脂肪衍生的间充质干细胞生骨能力稍逊于骨髓衍生的干细胞。然而，由于每个研究应用的技术手段不同，应用的培养基也略有不同，所以，人们对最终结论还不能进行更加准确的评估。

在活体，细胞不能在没有载体的情况下直接应用。因此，支架在向骨折区输送细胞的过程中起着重要的作用。同时，预先结合在支架中的各种因子可提供额外信号促使细胞转化为成骨细胞。目前有两个活体实验模型可以用于评估移植替代品诱导骨形成的潜能：一个为原位模型，目的是修复骨或骨折；另外一个为异位模型，共骨形成是在包括皮下组织的其他组织中完成。在大鼠股骨骨折模型中（原位模型），在骨折部位应用胶原-陶瓷作为支架载体种植上人的脂肪衍生间充质干细胞，而不加以额外的基因干预，结果骨折愈合失败，这表明人们需要应用更多的刺激因素去诱导细胞转化为骨细胞系。脂肪组织衍生干细胞与骨髓干细胞的不同之处在于后者可以自动生成骨。Hattori等在成骨培养基中培养脂肪衍生干细胞2周，然后将细胞植入小鼠皮下组织（异位模型）。细胞在蜂窝状的胶原蛋白支架内生成的骨与骨髓干细胞生成的骨相同。Yoon等也证实脂肪组织衍生干细胞在成骨培养基中预培养14天后，可以使活体中骨生成的概率升高。

利用脂肪组织衍生干细胞生成骨的另外一个方法是通过基因疗法使细胞产生骨形成传播因子。有研究将鼠脂肪组织衍生干细胞处理后生成骨形态发生蛋白-2，12例动物模型中有11例在细胞移植8周后骨折达到愈合。再生的骨组织质地强健，与大鼠的天然骨质相同。然而，本研究中干细胞生成的骨形态发生蛋白-2的量较高，超过了临床使用允许的范围。因此在临床应用中，需要掌握骨形态发生蛋白-2释放的可能性。对细胞进行基因调控目前仍然存在着很多问题，所以在其投入临床使用前，人们需要解决在安全性方面的相关问题（例如，排除其潜在的致肿瘤性）。

有关人骨缺陷和脂肪衍生干细胞实验的临床资料很少。有个案报道，一位7岁女孩成功地接受了脂肪组织衍生干细胞修复颅骨的缺损。另有一例报道，一位68岁男性，在口腔囊肿切除术后失去了部分硬腭，导致其无法进行正常咀嚼和饮水。外科专家们用自体皮下脂肪组织200g在自体血清中分离和培养扩增了脂肪组织衍生干细胞，然后将细胞植入含有骨形态发生蛋白2的支架（β磷酸三钙支架，塑型成缺损区形状）中，将该构架移植入患者腹直肌，在以后的8个月间通过X线监测其矿化过程。时机成熟时，将其植入颌面部缺损区，将上腹动脉与面动脉重新吻合。患者恢复了所有口腔功能，而且未产生任何并发症。

由于二期术式（包括干细胞的体外增殖）增加了患者的经济负担和手术不适，Helder等发展了一步法诱导骨生成。在100分钟内可以收获脂肪衍生干细胞，将其种植于骨诱导支架上，移植回术区。这个方法经羊脊柱融合模型检验，证明可以成功生成骨质。此方法是否能在轴向骨修复中取得成功还值得期待。

脂肪衍生干细胞在临床上得到普遍应用之前，还有一些问题需要解决。体外增殖培养的细胞面临很多问题，因为当细胞被移离其自然环境时，细胞的甲基化模式改变。而且，工业化培养必须保持在“绝对无尘室”内，以避免细胞污染。此外，在进入临床应用之前，必须进行检验以确保细胞无恶性转化倾向。最后，还需要计算出应用的辅助因子的量，以确保可以触发细胞的骨形成。

总之，在适当条件下，脂肪衍生干细胞可以在体外培养中和活体内发挥成骨作用。骨生成的数量可能没有骨髓干细胞生成骨那样丰富，但是这已足够治疗小型或大型哺乳类动物的骨缺陷。而且，与骨髓干细胞相比，脂肪衍生干细胞可增强血管分布、促使新骨血管生成、可以帮助解决大型骨移植面临的主要问题——即怎样使血管长入新移植的骨皮片。一旦解决了安全性和有效性的问题，脂肪衍生干细胞将会在整骨矫形外科得到广泛的应用。