脂肪的处理技术

美容外科的副产品，脂肪抽吸物一经获得，即可通过脂肪处理的特殊方法提取脂肪组织衍生干细胞，包括酶消化、过滤、离心得到富含脂肪衍生干细胞的基质血管碎片。然而，值得一提的是，自体脂肪移植已经经历了至少一个世纪的实践，直到20世纪90年代美国皮肤科医师 Sydney Coleman应用离心机之前，这些脂肪在移植前都未经脂肪处理。

（一）脂肪处理的简单技术

离心之前的简单脂肪处理技术包括过滤、清洗、用玻璃瓶分离和吸墨纸吸出油脂。Sydney Coleman 证实如果严格遵循脂肪准备和注射的程序，脂肪组织移植就可以达到满意的效果。

1.离心分离　离心分离可以用来离心脂肪细胞，使其与脂肪毒性物质、脂粒、蛋白酶、酯酶和血细胞分离开来。用来衡量离心力的参量有两个：每分钟转速和离心半径。尽管人们通常将前者作为参量，但是后者才是公认的离心的标准特征。离心的更准确计量单位是重力加速度，应为9.8m/s2。获取的脂肪经离心可分为三层：油脂上层，包括三酰甘油酯和细胞崩解后的乳糜；中层包含提纯后的脂肪；下层包括血液残留、血清和浸润麻醉所用的液体。

购买离心机时我们推荐选择那些转子和套筒可以进行蒸汽灭菌的类型，以减低污染的风险。Coleman设计了几种分别用于脂肪获取和注射的插管，它们之间具有很大分别。Coleman的插管及特殊的脂肪移植设备，都是由其本人设计，由Arizona、Tucson的Byron Medical Inc 生产经销。脂肪处理推荐的离心速率为3000转/分钟，离心3分钟，根据旋转半径的不同，分别对应为1207g或者1811g。至于离心力对细胞可能造成的影响和损伤，已经有多项研究正在探讨离心力对脂肪细胞和脂肪衍生干细胞存活的可能影响。

近期的一个研究表明，在离心率1200g时离心超过5分钟，3000g时离心超过1分钟，细胞的存活比例明显降低。

目前推荐的理想离心力为1200g，离心5分钟，由此获得的细胞才可以在脂肪移植中取得最好的长期和短期效果。

2.冷冻储存　脂肪处理的另一项技术是冷冻储存，以便使材料得到重复应用，这一技术最先由Shoshani及其同事在2001年引进。经吸脂获得的脂肪组织可以在–18℃家用冰箱中保存2周。将这些脂肪组织解融后再注射入裸鼠体内。将其与注射了新鲜获得脂肪的裸鼠相比较，在脂肪重量和体积上未见明显差别。

从脂肪抽吸物获取脂肪衍生干细胞时，需要将抽吸的脂肪分为两部分。用无菌的磷酸盐缓冲液彻底冲洗第一部分脂肪以去除红细胞和污染的组织碎片。然后应用含胶原酶的磷酸盐缓冲液（Ⅰ型，Sigma-Aldrich）在37℃孵育30分钟，同时进行轻柔搅拌。接着用10%的牛血清等量中和酶的活性。将上清液离心5分钟后，将细胞小球重新悬浮在10%的胎牛血清中，应用滤膜过滤去除组织碎片。将第二部分的脂肪抽吸物离心5分钟。上述处理得到的基质血管碎片可以在培养中扩增或者直接作为干细胞用于自体移植。如果需要将细胞在培养中增殖，即可将脂肪组织衍生干细胞种植在具有明胶涂层的培养皿上（30000细胞/cm2）置于37℃、5% CO2的潮湿环境中培养。在培养液中应该包含有0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、1µmol/L地塞米松、10µmol/L 胰岛素、200µmol/L 吲哚美辛和1%的抗生素/抗真菌素。1周后，将附壁细胞用胰酶消化后培养在同样的培养液中，每3天换液一次。

3.光调作用　ISCI和Adistem Ltd（创建于中国香港的生物技术公司）在近期推出了一种脂肪组织衍生干细胞处理的商业化模式，即Adilight1 LED 装置。据该公司描述，其可通过光调作用的方式激活脂肪组织衍生干细胞（图22-1）。伴随着这一产品的面世，Adistem 也生产可以供不同容量脂肪抽吸物提取干细胞的试剂盒，将其用于临床或者实验研究。应用光活化的原理应该是这样的，大量的脂肪组织衍生干细胞在脂肪组织中处于冬眠状态，因此需要将其激活之后才能完全发挥作用。Adistem 也将Adistem PRP试剂盒商品化，可以应用后者从患者的血小板提取生长因子。这些血小板来源的再生因子随即用来激活同一患者的脂肪衍生干细胞。Adistem 还开发了以一种完全不同的方式获取干细胞的脂肪处理程序。他们应用卵磷脂-脂质体因子取代酶类，而使整个提取过程缩短。

图22-1　应用 AdistemTM　技术进行静脉内注射治疗

（二）脂肪组织衍生干细胞处理的未来发展方向

目前可用的脂肪组织衍生干细胞处理技术在特定群体的细胞选择上有一定的潜在局限性，往往导致其相关技术效果不佳。这可能是造成我们不能深刻理解所观察组织修复机制的主要原因。希望在不远的将来，人们可以通过应用免疫或者体外功能分析来发展对脂肪组织衍生干细胞的分类挑选和选择，以克服这一局限性。