抗原与抗体结合形成细胞

本节热门考点

1.凝集反应是颗粒性抗原（细菌、细胞等）与相应抗体在电解质存在的条件下特异性结合后形成肉眼可见的凝集团块，沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体结合，在适当条件下出现肉眼可见的沉淀线。

2.免疫学检测的三大标记技术：酶免疫测定、免疫荧光技术和放射免疫测定。

3.淋巴细胞分离的主要方法：葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法，磁珠分离法，流式细胞术分离法。淋巴细胞转化的原理和应用。

4.细胞因子的检测：①生物活性测定法；②免疫学测定法，包括RIA和ELISA；③分子生物学法，包括原位杂交法和RT-PCR法。

一、抗体的检测及应用抗体进行的检测

1.概念　抗原与抗体发生结合反应的物质基础是抗原的抗原决定基与抗体的抗原结合部位之间的结构互补性，二者相互结合，通过一定方法，出现可见的反应。

2.血凝抑制　当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为血凝抑制反应。

3.凝集反应和血型的鉴定　细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下结合后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应。ABO血型检测就是利用玻片凝集试验，进行抗原的定性检测。

4.免疫荧光　免疫荧光法是用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中的抗原反应，置荧光显微镜下观察或采用流式细胞仪进行检测的技术。免疫荧光法可用于检查细菌、病毒、螺旋体等的抗原或相应抗体，帮助传染病的诊断。此外，还用于鉴定免疫细胞的CD分子，检测自身免疫病的抗核抗体等。

5.放射免疫　放射免疫测定法是用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测的技术，检测的敏感度可达pg/ml水平。

6.酶免疫（ELISA和免疫组化）　酶免疫测定是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。酶联免疫吸附试验（ELISA）是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，通过洗涤将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开，再采用酶-底物系统进行检测的技术。免疫组化技术是用标记物标记的抗体与组织或细胞的抗原反应，结合形态学检查，对抗原进行定性、定量、定位检测的技术。

7.免疫电镜　将抗体进行特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果，称为免疫电镜技术。根据标记方法的不同，分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。

8.免疫沉淀　免疫沉淀法是研究体内蛋白质之间相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与其他蛋白或DNA片段的结合情况，还可以用于研究信号转导通路以及基因表达等。

9.免疫印迹　免疫印迹法又称Western blotting，是将凝胶电泳与固相免疫结合，把电泳分区的蛋白质转移至固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。

二、免疫细胞的分离（常用方法）

1.Ficoll-Hypaque离心法　体外检测淋巴细胞，首先需制备外周血单个核细胞，常用的方法是葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。

2.磁珠分离法　将已知抗细胞表面标记的抗体交联物称为微珠（平均直径小于1.5μm的磁性颗粒），与细胞悬液反应后，磁珠借抗体结合于相应细胞群或亚群表面。再将细胞悬液加于一试管内并置磁场中，因磁珠被磁场吸引，将磁珠结合的细胞与未结合磁珠的细胞分开。

3.流式细胞术　流式细胞术是借助荧光激活细胞分选器（FACS）对免疫细胞及其他细胞进行快速准确鉴定和分类的技术。

流式细胞术：①测量速度快；②可进行多参数测量；③是一门综合性的高科技方法；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。

三、免疫细胞的特异性、数量和功能检测

1.流式细胞术　根据表面表达CD分子的种类、水平和多种CD表达格局，以流式细胞术可以二维荧光方图和比例统计显示待测细胞群体中某群CD+细胞的比例及数量、CD分子表达水平的高低，同时以IFNγ等细胞因子或AnnexinV凋亡标志等，可测定的功能性CTL、凋亡细胞的比例，以FITC等标记靶细胞，通过荧光强度的减弱程度可测定CTL的杀伤活性。

2.增殖试验

（1）3H-TdR掺入法：在PBMC中加入PHA共同培养，终止培养前8～15小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），由于3H-TdR能掺入细胞合成的DNA中，细胞增殖水平越高，掺入的放射性核素越多。培养结束后收集细胞，用液体闪烁仪测定样品的放射活性，反映细胞的增殖状况。

（2）MTT法：MTT是一种噻唑盐，化学名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑。在细胞培养终止前数小时加入的MTT，作为细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物参与反应，形成紫褐色的甲臜颗粒并沉积于细胞内或细胞周围。甲臜可被盐酸异丙醇或二甲基亚砜完全溶解，用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，反映细胞增殖水平的高低。

3.细胞毒试验　CTL、NK细胞对靶细胞有直接杀伤作用，可根据待检效应细胞的性质，选用相应的靶细胞，如肿瘤细胞、移植供体细胞等。可采用51Cr释放法、乳酸脱氢酶释放法以及凋亡细胞检查法进行检测。

4.细胞凋亡检测　检查靶细胞凋亡有多种方法：如琼脂糖电泳法、TUNEL法和流式细胞术等。

5.芯片技术　目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的“微阵列”，也被称为基因芯片或DNA芯片。

6.细胞因子的生物活性检测　根据细胞因子的生物学活性，选用相应的实验系统，包括细胞增殖法、直接杀伤法、保护细胞免受病毒致病变法等。如选用细胞因子依赖的细胞株，其增殖反应水平与细胞因子的含量成正相关，根据细胞株的增殖水平可确定样品中细胞因子（如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6等）的含量。