结核病的症状和体征往往不典型,虽可借助X线摄片诊断,但确诊仍有赖于细菌学检查。标本中找到结核菌是确诊结核病的主要依据,也是制订治疗方案、考核疗效、随访病情的重要指标,对每一例患者均应进行此项检查。常用的方法有直接涂片、集菌涂片、培养法等。标本的选择根据感染部位,可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸腔积液、腹水。肺外感染可取血或相应部位分泌液或组织细胞。
1.直接涂片镜检 标本直接涂片或集菌后涂片,抗酸染色。若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般用Ziehl-Neelsen法。为了加强染色,可用IK(intensified Kinyoun)法染色。将苯酚(石炭酸)复红染色过夜,用0.5%盐酸乙醇脱色30秒,则包括大多结核分枝杆菌L型也可着色。为提高镜检敏感性,也可用金胺染色,在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈现金黄色荧光。
2.浓缩集菌 先集菌后检查,可提高检出率。培养与动物试验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、腹水无杂菌,可直接离心沉淀集菌。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4%NaOH(痰和碱的比例为1∶4,尿、支气管灌洗液和碱的比例为1∶1)处理15分钟,时间过长易使结核分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标本先加5%鞣酸、5%乙酸各0.5毫升于锥形量筒内静置,取沉淀物处理。处理后的材料再离心沉淀。取沉淀物做涂片染色镜检。若需进一步做培养或动物接种,应先用酸中和后再离心沉淀。
3.分离培养 将经中和集菌的材料接种于固体培养基,器皿口加橡皮塞于37℃培养,每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢,一般需2～4周长成肉眼可见的落菌。液体培养可将集菌材料滴加于含血清的培养液,则可于1～2周在管底见有颗粒生长。取沉淀物涂片,能快速获得结果,并可进一步做生化、药敏等测定和区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。国内学者已证明,结核分枝杆菌L型可存在于血细胞内或黏附于细胞表面。这种患者往往血沉加快,用低渗盐水溶血后立即接种于高渗结核分枝杆菌L型培养基能提高培养阳性率。
直接涂片方法简单,但需每毫升痰含菌10万个方能得到阳性。集菌法阳性率较高,大约每毫升痰含1 000个结核杆菌即可阳性,但需24小时以上才有结果。痰中菌量少需用培养法或动物接种法方能检出,培养阳性时应做药敏试验,帮助选择有效抗结核药物,但需几周才有结果。痰菌阳性说明病灶是开放性的。痰菌阳性率受病灶的部位、病灶是否与支气管相通以及间歇排菌等因素影响,故痰菌阴性者亦不能轻易否定结核及其传染性。
痰涂片检查不仅可以明确结核传染源,而且十分经济,符合我国国情。涂片的优点是:①简便,技术要求低,不需特殊仪器设备;②快速,当天可得出结果;③价廉,所耗材料价格低廉。涂片的缺点是:①敏感性低,通常需5 000～10 000条菌/毫升才能够得到阳性结果;②特异性差,各种分枝杆菌均可着色,需要进一步鉴定是否为结核分枝杆菌:③无法区别死菌与活菌。痰涂片抗酸染色阳性检出率受检验人员的技术水平和收集痰液标本的质量影响很大,特别是咳痰的时间、痰标本的性状等因素。痰涂片荧光显微镜检查比光学显微镜检具有更高的灵敏度,且所需时间少,值得开展。培养的灵敏度略高于涂片法,并是鉴定活菌的可靠方法,还可进一步进行菌种鉴定和药敏试验,被誉为诊断结核病的“黄金标准”。但常规罗氏培养基培养时间长,需4～8周才能出结果,而且阳性率也只有30%～40%。同时各种分枝杆菌均可生长,需结合菌种鉴定才能确定是否为结核分枝杆菌。由于涂片和培养的检出率偏低,致使大量结核病人漏诊或误诊,不能适应临床诊治的需要。
痰涂片检查及分枝杆菌分离培养是常用两种检查方法。每例初诊患者应至少涂片检查3份痰标本。
痰涂片镜检结果:
(1)抗酸杆菌阴性:连续观察300个不同视野。未发现抗酸杆菌。
(2)抗酸杆菌阳性
①报告抗酸杆菌菌数:1～8条/300视野。
②抗酸杆菌阳性(+):3～9条/100视野。
③抗酸杆菌阳性(
):1～9条/10视野。
④抗酸杆菌阳性(
):1～9条/视野。
⑤抗酸杆菌阳性(
):≥10条/视野。
除了痰标本外,脓液、病灶组织,纤维支气管镜刷检物、冲洗或灌洗液,均可用于涂片检查。由于一些抗酸性染色颗粒难以辨认,当发现1条或少数“抗酸杆菌”时应列为可疑,重复检查。集菌法涂片和应用金胺染色荧光镜检可以提高阳性率,但假阳性有所增加。结核菌培养虽较费时,但培养菌株进一步做药敏试验测定,可为治疗特别是复治提供重要的参考。
培养结果
(1)分枝杆菌培养阴性(-):培养8周未见菌落生长者。
(2)分枝杆菌培养阳性
①分枝杆菌培养阳性(+):培养基斜面菌落分散生长,占据斜面面积的1/4以下者。
②分枝杆菌培养阳性(
):培养基斜面菌落分散生长,占据斜面面积的1/2以下者。
③分枝杆菌培养阳性(
):培养基斜面菌落密集生长或部分融合,占据斜面面积的3/4以下者。
④分枝杆菌培养阳性
):培养基斜面菌落密集生长呈苔样分布,占据全斜面者。
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