自身抗体测定

一、自身免疫病

【概述】健康个体的正常免疫调节功能会将自身耐受和自身免疫协调在一个相辅相成的合理水平上。当某种原因使自身免疫应答过分强烈时,也会导致相应的自身组织器官损伤或功能障碍,这种病理状态就称为自身免疫病(autoimmune disease,AID)。

【特点】

1.患者血液中可以检出高滴度的自身抗体和(或)与自身免疫组织成分起反应的致敏淋巴细胞。

2.患者组织器官的病理特征为免疫炎症,并且损伤的范围与自身抗体或致敏淋巴细胞所针对的抗原分布相对应。

3.用相同抗原在某些实验动物中可复制出相似的疾病模型,并能通过自身抗体或相应致敏淋巴细胞使疾病在同系动物间转移。

4.上述三个特点是自身免疫的三个基本特征,也是确定自身免疫病的三个基本条件。除此之外,目前所认识的自身免疫病往往还具有以下特点。

(1)多数病因不明,常呈自发性或特发性,有些与病毒感染或服用某类药物有关。

(2)病程一般较长,多呈反复发作和慢性迁延的过程,病情的严重程度与自身免疫应答呈平行关系。

(3)有遗传倾向,但多非单一基因作用的结果;HLA基因在某些自身免疫病中有肯定的作用。

(4)发病的性别和年龄倾向为女性多于男性,老年多于青少年。

(5)多数患者血清中可查到抗核抗体。

(6)易伴发于免疫缺陷病或恶性肿瘤。

【发病机制】许多自身免疫病的起始原因和发病机制尚不清楚。但不论何种原因使机体产生了针对自身抗原和抗体或致敏淋巴细胞时,就可以通过各种途径导致免疫炎症,使机体发生组织损伤或功能异常,表现相应的临床症状。

1.隐蔽抗原的释放　机体有些组织成分由于解剖位置的特殊性,正常情况下终生不与免疫系统接触,称为隐蔽抗原。例如眼晶状体、葡萄膜和精子等都是隐蔽抗原。机体不能建立对这些组织的免疫耐受性。出生后由于感染或外伤等原因,隐蔽抗原释放出来,与免疫系统接触便能诱导相应的自身免疫应答,导致自身免疫病发生,例如交感性眼炎等。

2.自身组织改变　一些理化因素(例如X线照射或服用某些药物)或生物学因素(例如受病毒感染)可直接引起组织抗原变性或改变细胞代谢过程的基因表达,从而改变自身抗原的性质,诱导自身应答,导致自身免疫病。例如自身免疫性溶血性贫血和特发性血小板减少性过敏性紫癜等。

3.共同抗原诱导　某些外源性抗原(例如微生物)与人体某些组织有类似的抗原结构,这些抗原进入人体后诱发的免疫应答可以针对相应的组织发生反应。例如A群β溶血性链球菌与人的心肌间质或肾小球基底膜有共同抗原,所以在链球菌感染后容易发生风湿性心脏病或肾小球肾炎。

4.先天易感性　遗传因素对自身免疫病的发生也起一定的作用。例如某些带有特殊HLA抗原的人群容易发生自身免疫病。

5.多克隆B细胞活化　有许多外源性或内源性的B细胞活化剂(例如细菌脂多糖、淋巴因子、抗Ig抗体等)可以直接作用于B细胞,使多克隆B细胞活化,包括针对自身抗原的B细胞也活化,绕过了T细胞的控制而产生自身免疫应答。

6.免疫调节失常　正常情况下,免疫功能处在一个调节网络的控制之下,当调节作用失控或抑制细胞缺陷时,可以使禁忌克隆的细胞复活,重新获得了对自身抗原的应答能力,就有可能发生自身免疫性疾病。所以在免疫缺陷病或恶性肿瘤时易伴发自身免疫病。这种理论很容易解释,但是很难得到证实。

【自身免疫病的分类】目前自身免疫病尚无统一的分类标准,可以按照不同方法来进行分类。常见自身免疫病分类见表1-5-1,常用方法有两种:①按发病部位的解剖系统进行分类,例如可分为结缔组织病、消化系统病和内分泌疾病等;②按病变组织的涉及范围进行分类,可分为器官特异性和非器官特异性两大类。

表1-5-1　常见自身免疫病分类

二、自身抗体测定

(一)抗核抗体测定

【概述】抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)又称抗核酸抗原抗体,是一组将自身真核细胞的各种成分,如脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称,能与所有动物的细胞核发生反应,主要存在于血清中,也可存在于胸腔积液、关节滑膜液和尿液中,是目前自身免疫性疾病最常用的筛查指标。抗核抗体在大多数自身免疫性疾病中均可呈阳性,如SLE、RA、混合型结缔组织病(MCTD)、干燥综合征(SS)、硬皮病和多发性肌炎等。而在一些急、慢性病毒感染,正常老年人等也可呈低滴度的阳性反应。

【检测原理】临床上常用的ANA筛选实验是间接免疫荧光抗核抗体检测(IFANA)。基本原理是患者血清存在的ANA(第一抗体)能与相应细胞核(浆)抗原成分结合,用荧光标记的抗人球蛋白抗体(第二抗体)复染,经过荧光显微镜观察即能反映ANA的存在,而且通过对患者血清做一定稀释后的检测,还可以对抗体含量做半定量(滴度)测定。

【参考区间】用间接免疫荧光抗核抗体检测法。

(1)ANA:半定量一般分为(-)、(+1∶100)、(++1∶320)、(+++1∶1000)、(++++1∶3200)、(+++++1∶10 000),临床上如果ANA(+)滴度≥1∶1000肯定可以考虑为结缔组织病或者自身免疫性疾病。具体结合其他临床病史、症状体征和实验室结果综合考虑。

(2)如果对初发患者ANA(+)≤1∶320,不能肯定,但也不能排除结缔组织病或者自身免疫性疾病的可能,要结合临床病史、症状体征和实验室结果综合考虑。一般ANA=(+1∶100)时,临床意义不大。

【临床意义】在下列疾病中,ANA抗体阳性的比例大致如下,疾病名称和阳性率分别是:系统性红斑狼疮(SLE):活动期95%～100%;幼年型风湿关节炎(JRA):20%～40%,非活动期80%～100%;非结缔组织病:10%～20%;类风湿关节炎(RA):30%～50%;多发性肌炎/皮肤炎(PM/DM):40%～60%;药物性狼疮(DLE):95%～100%;干燥综合征(SS):60%～80%;混合性结缔组织病(MCTD):95%～100%;硬皮病(SSc):70%～90%;此外慢性活动性肝炎(CAH)、重症肌无力(MG)、慢性淋巴性甲状腺炎也都有一定的阳性率。

【注意事项】

1.正常人群中,随着年龄的增长,体内抗核抗体也可出现低滴度的阳性。因此,临床症状是自身免疫性疾病诊断中非常重要的判断依据。

2.抗核抗体滴度≥1∶1000时,高度提示患有某种自身免疫性疾病,但滴度本身与疾病的活动性无相关关系。

3.抗核抗体仅作为筛查实验,缺乏特异性。但抗核抗体阴性对于SLE的阴性预测值较高,是SLE的最佳筛查指标。

(二)抗双链DNA抗体测定

【概述】DNA由两条单链组成,通常是由两条单链相互缠绕在一起的,像麻绳一样绞在一起的,抗dsDNA抗体主要识别双螺旋脱氧核糖核酸磷酸支架上的位点,因此与双链、单链DNA均能反应。针对双链DNA的抗体就叫作抗双链DNA抗体(DS-DNA)。抗双链DNA抗体又称为天然DNA抗体。

【检测方法】常用绿蝇短膜虫(CL)间接免疫荧光(IIF)、放射免疫分析法(Farr试验)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。

【参考区间】健康人血清1∶10稀释为阴性(绿蝇短膜虫法)。健康人结合率≤20%(放射免疫分析法Farr试验)。一般以待测血清A值/阴性对照A值(P/N)≥2.1为阳性;正常人P/N值<2.1(ELISA法)。

【临床意义】

1.明确诊断　抗dsDNA抗体是系统性红斑狼疮(SLE)的特异性抗体,和抗Sm抗体一起是该病的血清学标志物,阳性率60%～90%。虽然此抗体偶尔也可以在其他结缔组织病患者中出现,但主要还是出现在SLE患者体内,在活动期的SLE患者血液中阳性率可达90%以上。

2.监测病情　血液中抗双链DNA抗体(DS-DNA抗体)滴度的增加和降低直接与SLE患者的活动程度相关联,加重时抗体滴度增高,病情缓解时抗体滴度降低或者转阴,因此可以帮助临床医生病情变化,对疾病的治疗有指导作用。

3.提示肾脏病变　抗双链DNA抗体(DS-DNA抗体)阳性者往往合并肾脏损害,即狼疮肾炎,而抗双链DNA(DS-DNA抗体)抗体阴性者则提示肾脏损害较轻。因此,怀疑患SLE的患者或者已经诊断SLE的患者都要经常检查抗DS-DNA的抗体,以及早诊断疾病或发现病情变化。

4.其他　抗ssDNA抗体不仅见于系统性红斑狼疮患者(70%～95%),也与很多其他自身免疫性疾病有关[药物诱导性红斑狼疮(60%),混合性结缔组织病(20%～50%),多肌炎/皮肌炎,硬皮病(14%),干燥综合征(13%)和类风湿关节炎(8%)]。

【注意事项】上述几种检测技术的特异性都不是100%的。绿蝇短膜虫动基体中虽不含dsDNA,但可能含少量组蛋白;放免法、ELISA法等用作抗原的dsDNA,也常常含有ssDNA,而即使污染的ssDNA不足1%,引起的假阳性也可高达6%;此外,鉴于检测试剂中DNA抗原的来源不同,碱基组成和顺序可能有一定差异,致使抗体结合的表位发生变化进而影响结果。因此,对抗dsDNA的检测结果应结合临床分析,必要时应动态观察。

(三)抗ENA抗体测定

【概述】抗ENA抗体是一组自身抗体,也属于抗核抗体,ENA(extractable nuclear antigen)的中文名称是可提取的核抗原,它不含组蛋白,可以溶于盐水而被提取,针对ENA的抗体即称抗ENA抗体,它与疾病的严重程度或活动性无明显相关。抗ENA抗体主要包括抗Sm和nRNP等七种抗体。

【检测方法】斑点法。

【参考区间】正常人阴性。

【临床意义】

1.抗nRNP(nuclear RNP)抗体　以抗核内的核糖核蛋白而得名,由于其富含尿嘧啶(U),通常又把n RNP称之为U1RNP。具有抗原性的U1RNP其分子量有70k D、30k D和22k D。U1RNP抗体在混合性结缔组织病中几乎均为阳性,且其滴度很高;在其他结缔组织病中阳性率低且滴度低;它是区分结缔组织病和非结缔组织病的有力指标。抗U1RNP抗体阳性的患者,常有双手肿胀、雷诺现象、肌炎和指(趾)端硬化。有人认为抗U1RNP抗体阳性,则肾病发生率较低;如果抗dsDNA、抗Sm抗体同时存在,则发生狼疮性肾炎的可能性较大。

2.抗Sm抗体　以患者名字(Smith)命名。已知Sm是核内小核糖体蛋白(sn RNP)。其抗原决定簇主要在于U1、U2、U4～U6 RNA连接的B和D蛋白多肽上,已知蛋白多肽的分子量B(29k D)、B’(28k D)、D(16k D)。抗Sm抗体的蛋白多肽有较高特异性的为B带和D带。国际上通常用对流电泳和免疫双扩散法检测抗Sm抗体,其阳性率在SLE中为30%左右,抗Sm抗体对早期、不典型的SLE或经治疗缓解后的SLE回顾性诊断有很大帮助。从理论上讲,测抗Sm抗体的同时,大多测U1RNP,但抗U1RNP抗体阳性,则抗Sm抗体可为阴性。抗U1RNP抗体在系统性硬化症伴多发性肌炎的重叠综合征中频率较高。银屑病及雷诺现象的患者也可呈阳性。

3.抗SSA/Ro抗体　由于该抗体与干燥综合征相关,故取名SSA,也有人取名于最早检测到的患者名字Ro。SSA与Ro的抗原性、生化特点一致。SSA/Ro是含有Y-YRNA的蛋白质,更多存在于胞质内。在以鼠肝为底物的ANA检测中,抗SSA抗体常阴性,而以Hep-2细胞为底物,则ANA为阳性。

4.抗SSB/La、Ha抗体　也有人将SSB抗体以患者名字La命名。SSB/La是RNA多聚酶转录中的小RNA磷酸蛋白质。临床上常规采用对流电泳和免疫双扩散法检测抗SSA和抗SSB抗体。近两年来发展的免疫印迹检测中的抗SSA与分子量为60k D和52k D的两条蛋白多肽发生反应,有人认为60k D多肽在SLE中较SS更为多见。抗SSB与分子量为48k D、47k D、45k D的三条蛋白多肽反应,但48k D更有特异性。如上所述抗SSA/Ro和抗SSB/La、Ha与SS有关,在原发性SS患者中,抗SSA/Ro和抗SSB/La阳性率分别为60%和40%,但其他结缔组织病患者,该两种抗体亦可存在。抗SSB抗体较抗SSA抗体诊断SS更为特异。在临床上所谓ANA阴性的SLE患者,大部分有抗SSA抗体。抗SSA和抗SSB常与血管炎、淋巴结肿大、白细胞减少、光过敏、皮损、紫癜等临床症状有关。

5.抗r RNP抗体　rRNP(ribosome RNP)是主要在胞质中的一种磷酸蛋白,免疫印迹法测得r RNP抗体主要有38k D、16k D、15k D三条蛋白多肽,国外报道近一半的SLE患者有抗r RNP抗体常常在SLE活动期中及有内脏损害(如脑病)的患者中存在,与抗dsDNA的消长相平行。

6.抗PCNA(proliferating cell nuclear antigen)抗体　即抗增殖细胞的核抗原抗体,PCNA是分子量为36k D的DNA聚合酶副蛋白。用免疫双扩散法测得在SLE患者中阳性率为3%～5%,其他结缔组织病患者中常为阴性。

7.抗Ku抗体　以日本患者的名字命名。Ku是与DNA直接结合的70k D和80k D的蛋白二聚体。免疫双扩散检测PM/SSc重叠综合征的患者其阳性率为3%。ELISA测得该抗体在SLE中为39%,MCTD中55%有低滴度的抗Ku抗体。

8.抗Scl-70抗体　因该抗体主要在系统性硬化症(SSc)中出现,且其抗原分子量为70k D而得名。但Scl-70实为分子量为100k D的DNA拓异构酶1(topolsomerase 1)的降解产物。抗Scl-70抗体是SSc很特异的抗体,免疫双扩散检测在SSc中的阳性率为20%左右,免疫印迹检测阳性率约28%。目前较一致地认为SSc中抗Scl-70出现的频率高于局限性硬皮病,阳性率为18%。没有近端皮肤侵犯的CREST患者用免疫双扩散检测此抗体的阳性率为4%,免疫印迹阳性率为11%。抗Scl-70阳性患者病程长于阴性者。该抗体阳性的SSc患者以脏器受累、指端凹陷性瘢痕更常见。

9.抗Jo-1抗体　以患者名字John而得名。Jo-1抗原是分子量为50k D的组氨酰t RNA合成酶,以免疫双扩散法检测25%的PM/DM患者有此抗体。在合并肺间质病变的PM/DM患者中,抗Jo-1抗体高达60%,临床上还发现以急性发热、对称性关节炎、“技工手”、雷诺现象、肌炎并肺间质变的患者,抗Jo-1抗体常呈阳性,有人称之为抗Jo-1抗体综合征。抗Jo-1抗体常被视为PM/DM的标记抗体。

10.抗RA33抗体　该抗体是一种分子量为33k D核酸结合蛋白。1989年Hassfeld等发现RA中其阳性率为35.8%,尤其在早期RA患者血清中出现,抗RA33抗体的消长与病情和用药无关。

【注意事项】

1.条带显色的深浅与抗体的滴度相关。

2.抗原经亲和层析分离纯化。膜条上没有多余蛋白,不会产生非特异性的阳性反应。

3.所有的温育过程都在室温中进行。使用旋转摇床,以保证反应最佳的敏感性。

4.温育过的载片可长期保存,实验结果容易存档。

(四)抗中性粒细胞胞浆抗体测定

【概述】抗中性粒细胞抗体(ANCA)是指与中性粒细胞及单核细胞胞浆中溶酶体酶发生反应的抗体。当中性粒细胞受抗原刺激后,胞质中的α-颗粒释放蛋白酶-3、髓过氧化物酶物质及白细胞抗原生成,刺激机体而产生ANCA。该组抗体可表达为IgG、Ig M或Ig A。ANCA最早于1982年在坏死性肾小球肾炎患者血清中发现,现已证实该抗体是系统性血管炎的血清标志性抗体。

【检测方法】间接免疫荧光法。

【参考区间】正常人无此抗体;阳性荧光染色模型分:胞质型(c ANCA)、核周型(p ANCA)、非典型ANCA(x ANCA)。

【临床意义】

1.c ANCA 抗原主要是蛋白酶-3(PR3-proteinase)。它是中性粒细胞嗜天青颗粒的主要成分,分子量为29 000k D的糖蛋白,pH=7.8,能水解弹性蛋白酶、Ⅳ型胶原纤维等多种组织成分。c ANCA主要见于韦格纳肉芽肿(阳性率占80%,且与病程、严重性和活动性有关)是Wegener(WG)肉芽肿病的特异性抗体。C-ANCA对呼吸道有亲合性,致上下呼吸道坏死、肉芽肿形成。C-ANCA阳性也可见于少数显微镜下多动脉炎(MPA)、Churg-Strauss综合征(CSS)、结节性多动脉炎(PAN)、少数巨细胞动脉炎、过敏性紫癜、白细胞破碎性皮肤性血管炎。

2.p ANCA 抗原主要为髓过氧化物酶(MPO)。它是中性粒细胞嗜天青颗粒中的另一主要成分,分子量为146 000k D,pH=11.0,是中性粒细胞颗粒中杀伤系统的主要成分。p ANCA不如c ANCA具有诊断特异性。p ANCA阳性主要见于特发性坏死性新月体性肾小球肾炎(NCGN)、显微镜下多动脉炎(MPA)。也可见于Churg-Strauss综合征(CSS)、结节性多动脉炎(PAN)、SLE、RA、SS、SSc。在NCGN、MPA中p ANCA和c ANCA阳性率几乎相同。相对而言,p ANCA患者的血管炎病变程度重,常有多系统损害。

3.非典型ANCA(x ANCA) 它代表了p ANCA和c ANCA的混合物。阳性见于溃疡性结肠炎、自身免疫性肝炎和慢性炎症疾病(表1-5-2)。

表1-5-2　pANCA和c ANCA 的靶抗原及临床意义

【注意事项】

1.本试验适于韦格纳肉芽肿、各种肾小球肾炎、原发性硬化性胆管炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病。

2.用乙醇固定的中性粒细胞检测ANCA,可区分出两种荧光模型:均匀分布在整个细胞质中的颗粒样荧光,细胞核阴性(胞质型,c ANCA);或围绕核周的光滑的带状荧光(核周型,p ANCA)。

3.EUROPLUSTM基质PR3和MPO针对中性粒细胞筛查结果进行单特异性实验确认。而重组的GBM EUROPLUSTM基质可对诊断提供额外的可靠性。这有助于对难以判读的荧光模式进行评价(如其他胞质抗体产生的非特异性荧光)。

(五)抗心磷脂抗体测定

【概述】抗心磷脂抗体(anticardiolipin,ACA)是一种以血小板和内皮细胞膜上带负电荷的心磷脂作为靶抗原的自身抗体。ACA的免疫学分型有IgG、Ig A和Ig M三类,ACA的发生率男女无明显差异。常见于系统性红斑狼疮(SLE)及其他自身免疫性疾病。该抗体与血栓形成、血小板、自然流产或宫内死胎关系密切。

【检测方法】间接ELISA法。

【参考区间】正常人为阴性。

【临床意义】

1.抗心磷脂抗体阳性或持续升高与患者的动静脉血栓形成、血小板减少、反复自发性流产及神经系统损伤为特征的多系统受累的抗磷脂综合征(APS)密切相关。

2.抗心磷脂抗体在SLE患者中阳性检出率很高,总阳性率可达70%～80%,IgG型可达50%～60%,Ig M型可达40%～50%。抗心磷脂抗体阳性SLE患者发生血管炎、溶血性贫血、心脏及中枢神经系统损害的概率明显高于抗心磷脂抗体阴性者,ACA抗体阳性的SLE女性患者因血小板凝集功能增强,血栓素增加,更易形成血栓,妊娠时易发生流产。血清及脑脊液中抗心磷脂抗体的检测有助于神经精神性狼疮患者的临床诊断。

3.抗心磷脂抗体在RA患者中的阳性率可达33%～49%,幼年型RA患者可达42%～59%,抗心磷脂抗体检测是了解疾病进展及是否伴发APS的实验室指标。在急性脑血管病患者中高水平的IgG型ACA抗体是预后不良的危险信号,抗心磷脂抗体水平降低,病情好转;复发性脑梗死患者血清中抗心磷脂抗体水平高于原发性脑梗死患者,抗心磷脂抗体阳性是脑出血及脑梗死的危险因素。

4.非自身免疫性疾病患者,抗心磷脂抗体阳性者发生反复自然流产的多于抗心磷脂抗体阴性者,在抗心磷脂抗体阳性的孕妇中,发生胎儿生长迟缓的概率约为15.0%,而在抗心磷脂抗体阴性孕妇中,胎儿生长迟缓的发生率仅为1.7%左右,抗心磷脂抗体与反复自然流产和胎儿发育迟缓有一定相关性。

【注意事项】

1.与腺病毒、风疹病毒、水痘病毒、腮腺炎病毒等感染有关。

2.其他疾病,如支原体系统疾病等。

3.口服某些药物,如氯丙嗪、吩噻嗪等。

4.少数无明显气质性疾病的正常人,特别是老年人。

(朱一堂　李永军　郭映辉)