结核菌培养未见分枝杆菌生长

分枝杆菌与放线菌统属放线菌目(Actinomycetates)。放线菌(Actinomyces)是一群在生物学特性上与细菌类同的原核细胞型微生物,与分枝杆菌、棒状杆菌等有着亲缘关系,对人致病的主要有放线菌属和诺卡菌属。

分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略带弯曲专性需氧性杆菌,有时分枝,可呈丝状或菌丝样生长,振动可分裂为杆状或球状体,但无肉眼可见的气生菌丝体。不易为革兰染液着染但一般认为革兰染色阳性。本菌属的多数细菌在生长的一定时期抵抗酸-醇(acidalcohol-fast),故又称抗酸杆菌(acid-fast bacillus)。细菌体内含有分枝菌酸,细胞壁含有大量脂类,这与分枝杆菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相关,其DNA的G+C mol%为61～71。

本菌属的细菌种类众多,现已被鉴定的有150余种,包括专性寄生菌、腐生菌和中间型。根据国际分枝杆菌分类研究组(IWGMT)的方案将本属细菌分为三类,即缓慢生长菌、迅速生长菌和不能培养菌三种类型。Runyon按细菌产色素和生长速度进一步将非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)分为RunyonⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ群。

放线菌多数不致病,对人致病的主要有放线菌属和诺卡菌属。前者为厌氧或微需氧菌,细胞壁中不含分枝菌酸,多引起内源性感染;后者为需氧菌,细胞壁中含有分枝菌酸,非人体正常菌群的成员,常引起外源性感染。放线菌与诺卡菌的区别见表1-6-23。

表1-6-23　放线菌与诺卡菌的区别

一、结核分枝杆菌

【概述】结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)简称结核杆菌,是人和动物结核病的病原菌,包括人结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、坎纳分枝杆菌(M.canettii)和田鼠分枝杆菌(M.microti)等,前四种细菌对人类致病,其DNA-DNA之间的同源性大于95%,其中人结核分枝杆菌感染率最高。

结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌,有时可见分枝状,无芽胞和鞭毛,因衰老和抗结核药物的作用可出现多种形态,如球状、串珠状或丝状。本菌为典型的抗酸杆菌,由于结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质而不易着色,故一般不用革兰染色。但在加温条件下,结核分枝杆菌经5%石碳酸复红染色后,能抵抗3%盐酸酒精脱色作用(抗酸性)。齐-尼染色(Ziehl-Neelsen technique)是常用的抗酸染色(acid-fast stain)法,染色后结核分枝杆菌呈红色,背景呈蓝色。用荧光染料金胺“O”染色,在荧光显微镜下菌体呈橘黄色。

专性需氧菌,3%～5%CO2能促进其生长。营养要求较高,必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基上才能生长良好。最适生长温度为35～37℃,最适pH 6.5～6.8。生长缓慢,14～18h分裂1次,在固体培养基上2～5周才出现肉眼可见的菌落。典型菌落为粗糙型,表面干燥呈颗粒状,不透明,乳白色或淡黄色,如菜花样。菌落粗糙可能与菌体内含有高浓度的脂质有关。液体培养时生成菌膜。如培养液中加入吐温-80(Tween-80)可使细菌分散,均匀生长。有毒株在液体培养基中呈索状生长。

【鉴别要点】

1.标本采集　根据感染部位的不同,采集不同的标本。痰液标本最好为清晨第一口痰,盛于清洁干燥的无菌容器内送检。尿液收集应取清晨第一次全部尿量或24h尿沉淀10～15ml送检,必要时作无菌导尿送检。采集胃液可于空腹时抽取胃液或洗胃液(特别是儿童)置无菌瓶中送检。无菌抽取脑脊液、胸腔积液、腹水及关节液等盛于无菌容器送检。脑脊液标本静置后,表面可有细薄凝块,取凝块作涂片或接种培养。采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物。深部脓肿用无菌注射器抽取,置无菌容器送检。棉拭子采集的标本应直接放置肉汤中培养。

2.鉴别方法

(1)生化反应:结核分枝杆菌不发酵糖类,能产生过氧化氢酶。人型结核分枝杆菌能合成烟酸,还原硝酸盐,耐受噻吩-2-羧酸酰肼,而牛型结核分枝杆菌则不能。人型和牛型的毒株中性红试验均阳性,无毒株则为阴性,并失去索状生长现象。传统的生化反应鉴定操作相对烦琐、费时,需4～8周,影响因素多,如菌量、菌龄,尤其是菌量控制无客观标准,重复性差。

(2)药物敏感性试验:将分离的结核分枝杆菌纯培养物制备成菌悬液,接种于含各种浓度药物的固体培养基上,同时做不含药物的对照组。经过培养,含有药物的培养基上菌落数目是对照组的75%以上,则认为该菌对该药物浓度为完全耐药,如无菌落生长则为敏感。

(3)免疫学诊断:结核菌(TB)进入人体后,可以诱导机体产生抗感染的细胞免疫,也能产生抗结核杆菌的抗体反应。结核杆菌感染检测的免疫学方法有以下几种。

①结核菌素试验(tuberculin test):包括针对旧结核菌素(old tuberculin,OT)与结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)两种菌体蛋白。

②分枝杆菌抗体检测:结核抗体是检查结核的一项重要辅助指标。检测血清中的结核IgG抗体,比传统的痰涂片抗酸染色、结核杆菌培养等方法简便、快速、敏感性高,但也存在一定的假阳性,应注意鉴别;在胸膜结核、腹腔结核的体腔液、结核性脑膜炎的脑脊液中,结核抗体滴度明显高于血液中;PCR法检测DNA特异性更强,敏感性更高,但应防止标本污染出现假阳性。

③全血干扰素测定法:当全血与PPD和对照抗原(植物血凝素)共同孵育后,致敏的淋巴细胞可分泌IFN-γ,通过检测IFN-γ的含量来鉴定菌种。本试验所得结果与结核菌素试验相当,且具有受BCG接种影响小、又能与非结核分枝杆菌进行区分的优点,同时还可避免结核菌素试验在操作上与结果判断上存在的主观因素的影响。

除上述方法学之外,还可以通过噬菌体鉴定法(PhaB)、分枝杆菌分子生物法、高效液相色谱(HPLC)等手段进行该菌种的鉴定。

【临床意义】

人型结核分枝杆菌主要通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径感染机体,引起多种脏器组织的结核病,其中以肺结核为多见。结核分枝杆菌因细胞壁含有大量脂类,故对理化因素抵抗力较强。耐干燥,在干燥的痰内可存活6～8个月,含有结核分枝杆菌痰液的尘埃经8～10d仍有传染性。此菌对化学消毒剂的抵抗力也较一般细菌强。

结核分枝杆菌特有细胞壁能降低多数药物通透性,结核分枝杆菌也能产生诸如β-内酰胺酶的降解酶类和其他药物修饰酶。因此,结核杆菌对常见抗菌药物天然耐药。由于基因突变的发生,有2/3以上的结核分枝杆菌菌株对多种抗结核药物产生耐药性。多重耐药结核病(multiple-drug resistance tuberculosis,MDRTB)已成为全球共同面临的挑战。

二、非结核分枝杆菌

【概述】非结核分枝杆菌(NTM)不是分类学上的名称,是指结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。因其在染色反应上具有抗酸性,曾被称为非典型分枝杆菌。本菌为抗酸杆菌,但较结核分枝杆菌短而粗,大小(1～8)μm×(0.3～0.5)μm,抗酸染色着色均匀,呈束状或团状排列。

【鉴别要点】由于该菌引起的肺部感染在临床上难以与结核分枝杆菌感染区别,而且此类菌多数对常用抗菌药物和抗结核药物耐药,所以鉴别非结核分枝杆菌具有重要的意义。非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌的鉴别见表1-6-24。

表1-6-24　非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌的区别

1.产色分枝杆菌(RunyonⅠ群)　该群细菌的菌落特点是在暗处一般不产生或仅产生少量色素,光照1h后能在48h内转为黄色或橘黄色。需在营养成分复杂的培养基上才能生长,生长缓慢,菌落光滑。有时可形成索状生长。对人有致病性的有堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿分枝杆菌。

(1)堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii):本菌广泛分布于水和土壤中。菌体为细长杆状,长5～8μm,成对排列。最适生长温度为32℃,22℃以下及44℃以上均不能生长。暗处培养菌落为浅黄色,光照试验后为黄色或橘黄色。在鸡蛋固体培养基上呈S型的丘状菌落,易于乳化。本菌能引起肺内和肺外类似结核样的病变。

(2)海分枝杆菌(M.marinum):存在于淡水或海水中,为水中的腐生菌。菌体形态为棒状,长度中等。生长温度为25～35℃,尤其在25℃时生长迅速。鸡蛋固体培养基上呈S型凸起的菌落,生长于暗处时无色素产生,曝光后产生艳黄色色素。除可引起冷血动物(如鱼)感染外,亦能引起人的感染。尤其在游泳池接触水时,通过皮肤微小创口侵入皮肤而引起所谓的“游泳池肉芽肿”。渔业工人亦可经受损皮肤遭受感染。

(3)猿分枝杆菌(M.simiae):首先从猿分离到此菌,而后从人体中也分离出此菌。形态同结核分枝杆菌。28～37℃均可生长,45℃不能生长。生长缓慢,2万方可见菌落,菌落为光滑型,光照试验产生黄色色素。

2.暗产色分枝杆菌(RunyonⅡ群)　该群分枝杆菌无论有光或无光均能产生色素,呈黄色或橘黄色。生长缓慢,菌落为光滑型。对人有致病性的有瘰痢分枝杆菌和斯氏分枝杆菌。

(1)瘰痢分枝杆菌(M.scrofulaceum):菌体呈短棒状或纤细丝状。在鸡蛋培养基上菌落为S型丘状菌落,光照及暗处均可形成橘黄色色素。25～37℃均可生长,以35℃最为适宜,45℃则不能生长。本菌可引起人的淋巴结炎或肺部感染。

(2)斯氏分枝杆菌(M.szulgai):菌体呈短小棒状。在鸡蛋培养基上生长丘状、边缘不整的R型菌落。25～37℃均可生长,45℃则不能生长,突出特点是在37℃时为暗产色,在25℃时为光产色。该菌可引起成人肺部的慢性感染。

3.不产色分枝杆菌(RunyonⅢ群)　本群分枝杆菌缺乏β-胡萝卜素,故在光照和暗处均不能产生色素。对人有致病性的有鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌。

(1)鸟-胞内复合分枝杆菌(M.avium-intracellulare complex,MAC or MAIC):鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌有许多相似之处,故合起来称之为MAC。其生长温度为37～40℃,25℃或40℃有时亦可生长。在鸡蛋培养基上长出边缘整齐、S型丘状菌落,不产生色素。近年来发现HIV感染和AIDS患者易感染分枝杆菌,其中绝大多数为MAC,其对现行的抗结核药物均不敏感或耐药。

(2)溃疡分枝杆菌(M.ulcerans):菌体为中等长度的棒状。在鸡蛋培养基上长出小丘状、透亮的菌落。生长温度为30～33℃,在37℃不生长。对人可通过创伤局部感染,常在四肢伸侧形成无痛性溃疡,叫作Buruli溃疡,缓慢愈合或出现继发感染。

(3)蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi):菌体为长杆状或丝状。在鸡蛋培养基上长出边缘整齐,无色的S型菌落。生长温度为37～45℃,最适温度为40～45℃。是蟾蜍肉芽肿的病原菌,对人则多引起老年男性的慢性肺部感染。

4.迅速生长分枝杆菌(RunyonⅣ群)　本群分枝杆菌在普通培养基上即可生长,最适生长温度为25～45℃,生长速度快,3～6d即可形成菌落。对人有致病性的有偶发分枝杆菌和龟分枝杆菌等。

(1)偶发分枝杆菌(M.fortuitum):菌体呈棒状,亦可呈球状或细丝状,来自活体内的菌可见明显的分丝。生长温度为25～37℃,多数菌株能耐受22℃和44℃,在45℃时不能生长。生长速度快,5d内可见菌落。在鸡蛋培养基上长出扁平、边缘不整的S型菌落,亦常见丘状R型菌落。无色素形成,但在含孔雀绿的培养基上染料常被吸收而使菌落变为绿色。可引起人的局部感染或肺部感染,对现有的抗结核药物均耐药。

(2)龟分枝杆菌(M.chelonei):菌体呈多形性,大小不一。生长迅速,在鸡蛋培养基上3～5d即可见S型、丘状、边缘整齐的无色菌落。生长温度为22～40℃,42℃时不能生长,注意初代分离要求28～30℃。该菌在引起免疫力低下患者感染的快速生长非结核分枝杆菌中最常见,外伤引起的软组织病变及手术后继发感染,亦可引起肺部感染。龟分枝杆菌与脓肿分枝杆菌类似。以前曾划分为龟分枝杆菌下的两个亚种,即龟分枝杆菌(M.chelonei subsp chelonei)和龟分枝杆菌脓肿亚种(M.chelonei subsp abscessus)。但龟分枝杆菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源生长。

(3)脓肿分枝杆菌(M.abscessus):该菌与龟分枝杆菌关系密切。常存在于自来水中,常引起注射后医院感染的暴发,该菌也可散发引起丰胸术后、中心静脉插管、动脉插管以及透析导管所致的菌血症。

【临床意义】非结核分枝杆菌(NTM)广泛分布于外界环境及正常人和动物机体中。迄今为止已发现150余种,其中约1/3与人类疾病有关。近年来,由NTM引起的感染呈逐渐上升的趋势,日益引起国内外的关注。NTM病在患有肺部疾病的老年患者、HIV/AIDS患者、长期使用免疫抑制剂患者和器官移植术后患者中更为常见。结核病和NTM感染的治疗是不同的,因为许多一线和二线的抗结核药物对NTM均无效,且治疗方案与分枝杆菌的类别、感染的部位及感染严重程度等许多因素相关。MTB与NTM还可能发生混合感染,正确的菌种鉴定对常规治疗无效、复发及免疫缺陷的患者十分重要,早期进行菌种鉴定也可以帮助选择有效的药物及时进行治疗,降低发病率和死亡率。

三、麻风分枝杆菌

【概述】麻风分枝杆菌(M.leprae)是麻风病的病原菌,1873年挪威学者Armauer Hansen从麻风患者皮肤结节中发现本菌,又名Hansen杆菌。本菌为抗酸杆菌,但较结核分枝杆菌短而粗,大小为(1～8)μm×(0.3～0.5)μm,抗酸染色着色均匀,呈束状或团状排列。麻风分枝杆菌为典型的胞内寄生菌,有麻风分枝杆菌存在的细胞胞质呈泡沫状,称为麻风细胞。用药后细菌可断裂为颗粒状、链杆状等,着色不均匀,叫作不完整菌。革兰染色阳性,无鞭毛、无荚膜、无芽胞。

【鉴别要点】

1.标本采集　通常自眶上、颧下、下颌、耳郭及鼻腔黏膜等数处采取标本。

2.标本直接检查

(1)显微镜检查:消毒后切开表皮,深达真皮,用刀刮取组织液做涂片,火焰固定,抗酸染色、镜检,麻风分枝杆菌呈红色,细胞呈蓝色。金胺“O”染色、荧光显微镜检查,可提高阳性率。瘤型、界线类多为麻风杆菌阳性。在镜检时应注意与结核分枝杆菌形态相鉴别。麻风分枝杆菌多呈束状或成团聚集,结核分枝杆菌多散在,偶有聚集。麻风分枝杆菌菌体粗直,两端尖细,而结核分枝杆菌则细长略弯曲,且有分枝现象。在镜下可见大量的麻风分枝杆菌存在于细胞内,这种细胞的胞质呈泡沫状,称麻风细胞。

(2)活组织切片:抗酸染色及病理学检查。

【临床意义】麻风是一种慢性传染病,主要表现为皮肤、黏膜和神经末梢的损害。晚期可侵犯深部组织和器官,形成肉芽肿。麻风病在世界各地均有流行,据WHO 1994年统计,全世界1993年仍有310万麻风病例。根据中国性病麻风病控制中心监测室统计,麻风病在我国的现病人数已由1957年的大约40万减少到1997年现病例4050人。新发现病例由1958年的3.5万人降至1997年1800人,患病率由1966年2.4万人降至1997年0.033万人。现有病例主要集中在偏僻山区、草原牧区及贫困落后地区。最近有野生犰狳、猩猩等自然感染麻风的报道,可见麻风不仅是人类传染病,还是人兽共患的疾病。

四、放线菌属

【概述】放线菌(Actinomyces)能引起牛和人的疾病,分别在1876年、1878年被首先报道。1891年,Wolff和Israel应用厌氧培养法,首先将人型放线菌培养成功。目前发现衣氏放线菌(A.israelii)、内氏放线菌(A.naeslundii)、黏液放线菌(A.viscous)、龋齿放线菌(A.odontolyticus)及丙酸蛛网菌(Arachniapropionica)5种可引起人的放线菌病,其中衣氏放线菌最多见。牛型放线菌(A.bovis)主要引起牛的放线菌病。

放线菌无典型的细胞核,无核膜、核仁、线粒体等。细胞壁由糖肽复合物构成,含有胞壁酸。以裂殖方式繁殖,常形成分枝状无隔营养菌丝,但不形成空中菌丝,有时断裂成短杆状或球状,直径0.5～0.6μm。革兰染色阳性,无芽胞、荚膜和鞭毛。

厌氧性丝状杆菌,外形酷似类白喉杆菌。在动物体内与培养基上的形态有所不同,在脓汁标本中可见到分枝缠绕的小菌落,即硫磺样颗粒。将硫磺样颗粒制成压片或组织切片,镜下观察发现颗粒呈菊花状,由中央和周围两部分构成,中央为革兰阳性的丝状体,周围为粗大的革兰阴性棒状体,呈放线状排列。病理标本苏木精伊红染色,中央部为紫色,末端膨大部为红色。

【鉴别要点】

1.标本采集　取患者局部病灶组织、窦腔、瘘管的脓汁、痰液或活检组织。寻找有无“硫磺颗粒”,可用灭菌注射器抽取未破脓肿进行检查,脓肿破裂后“硫磺颗粒”则不易发现。

2.标本直接检查　将“硫磺颗粒”置于玻片上,盖上盖玻片轻轻压平后显微镜检查,可见颗粒呈菊花状,由棒状长菌丝呈放射状排列。颗粒核心由分枝菌丝交织组成,革兰染色阳性。菌丝末端因包有胶样物质的鞘而呈棒状膨大,折射率强,革兰阴性。病理标本经苏木精伊红染色,中央部为紫色,末端膨大部为红色。

3.分离培养　放线菌培养较困难,厌氧或微需氧,在有氧环境中一般不生长。初次分离加5%CO2可促进其生长。厌氧环境37℃3～7d观察结果,在血平板上形成灰白色或淡黄色粗糙而不规则的菌落,不溶血,经人工多次移种培养后,可形成光滑、白色、有光泽菌落。

4.生化反应鉴定　除黏液放线菌外,其他放线菌过氧化氢酶试验均为阴性。衣氏放线菌分解葡萄糖、木糖、棉子糖、甘露糖和甘露醇,产酸不产气,不水解淀粉。能将硝酸盐还原成亚硝酸盐(80%阳性)。牛型放线菌在葡萄糖中产酸不产气,在木糖、棉子糖、甘露糖和甘露醇中不产酸,水解淀粉。不能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

【临床意义】对人类致病的通常是衣氏放线菌和牛型放线菌。放线菌大多存在于正常人口腔、上呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道等与外界相通的腔道,属于正常菌群的成员。在机体抵抗力减弱、口腔卫生不良、拔牙或外伤时,导致软组织的化脓性炎症。若无继发感染,放线菌感染多为慢性无痛性,常伴有多发性瘘管形成,属于内源性感染。

五、诺卡菌

【概述】诺卡菌属(Nocardia)至少包括22个菌种,医学上常见的有脓肿诺卡菌(N.abscessus)、非洲诺卡菌(N.africana)、星状诺卡菌(N.asteroides)、巴西诺卡菌(N.brasiliensis)、短链诺卡菌复合群(N.brevicatena complex)、肉色诺卡菌(N.carnea)、鼻疽诺卡菌(N.farcinica)、新星诺卡菌(N.nova)等13个种。

广泛分布于土壤中,多为腐物寄生性的非病原菌,部分能引起人或动物急性或慢性诺卡菌病。引起人类感染较罕见,可发生在一些慢性进行性疾病或免疫障碍疾病晚期,尤其是库欣综合征、糖尿病、艾滋病或长期应用皮质类激素、免疫抑制剂和广谱抗生素的患者。诺卡菌可感染牛、狗等哺乳动物,亦可感染鸟和鱼。

革兰染色着色不均,一般认为该菌为革兰阳性杆菌。有细长的分枝菌丝,生长于表面并伸入琼脂培养基中,或同时有杆状或球状体存在。丝状体呈粗细不等的串珠状。生长的某个时期有弱抗酸性。形态与放线菌相似,但菌丝末端不膨大。

【鉴别要点】

1.标本采集　采集组织渗出液、痰、脊髓液或其他病理材料,查找黄红色或黑色颗粒,颗粒直径通常小于1mm。

2.标本直接检查　将病灶组织或渗出液标本置平皿内仔细检查带色素小颗粒,并置玻片上压碎、染色、显微镜检查,镜下为菌团,可见色素颗粒呈菊花状,中心部位为革兰阳性,边缘的流苏样棒状体为革兰阴性。菌丝末端不膨大,革兰染色阳性。在脑脊液、胸腔穿刺液及痰中多不形成颗粒。抗酸染色呈弱抗酸性,应注意与结核分枝杆菌的区别。

3.分离培养与鉴定　专性需氧,在普通培养基或沙氏琼脂培养基中室温或37℃可缓慢生长,45℃时可生长。菌落大小不等,表面有皱褶,颗粒状。不同种类可产生不同色素,如橙红、粉红、黄、黄绿、紫以及其他颜色。星形诺卡菌菌落呈黄色或深橙色,表面无白色菌丝。巴西诺卡菌菌落表面有白色菌丝生长。豚鼠耳炎诺卡菌类似星形诺卡菌,呈黄色或橘黄色。在液体培养基中,常在表面生长成菌膜,下部培养基澄清。

【临床意义】星形诺卡菌主要通过呼吸道引起人的原发性、化脓性肺部感染,可出现肺结核的症状。肺部病灶可转移到皮下组织,形成脓肿、溃疡和多发性瘘管,也可扩散到其他器官,如引起脑脓肿、腹膜炎等。组织病理变化主要表现为化脓性肉芽肿样改变,在感染的组织内及脓汁内也有类似“硫磺颗粒”,呈淡黄色、红色或黑色,称色素颗粒。

巴西诺卡菌可因侵入皮下组织,引起慢性化脓性肉芽肿,表现为肿胀、脓肿及多发性瘘管,好发于腿部,称为足分枝菌病(mycetoma),本病亦可能由星形诺卡菌、马杜拉放线菌及某些真菌引起。

(赵建宏　郭映辉　张金艳)