【目的】正确掌握网织红细胞计数方法。
【方法】试管法、Miller窥盘计数法。
【标本类型】新鲜全血(EDTA-K 2抗凝)。
【试剂】10g/L新亚甲蓝(或煌焦油蓝)生理盐水溶液。
【器材】普通光学显微镜、Miller窥盘、一次性试管、试管架、载玻片、香柏油、擦镜纸、清洁液等。
【操作步骤】
1.操作前准备:戴口罩、帽子、手套,穿工作服,准备并清点本试验所需器材。
2.取一次性试管一支,取10g/L新亚甲蓝(或煌焦油蓝)生理盐水溶液2滴加于试管底部。
3.充分混匀新鲜全血标本,取2滴加入上述试管中,立即混匀,室温下放置15～20min。
4.取充分混匀已经染色的血液1滴滴于载玻片近一端1/3处,握住另一张边缘光滑的推片,以30°～45°使血滴沿推片迅速散开,快速、平稳地推动推片至载玻片的另一端,制成薄片,待自然干燥。
5.先用低倍镜观察全片,观察红细胞的染色情况和分布情况,并选择红细胞分布均匀、着色较好的区域作为计数区域。
6.在油镜下对所选区域滴加香柏油1滴,计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数,求出网织红细胞所占百分比。或用Miller窥盘计数法,在油镜下计数Miller窥盘圆形玻片两个正方形格子中小方格内红细胞和大方格内的网织红细胞。
7.计算
(1)试管法:网织红细胞百分数=计数1000个红细胞中的网织红细胞数/1000×100%。
(2)Miller窥盘法:网织红细胞百分数=大方格内的网织红细胞数/小方格内的红细胞数×9×100%。
8.操作后正确处理医疗垃圾,实验器材归回原位。
【注意事项】
1.煌焦油蓝染液溶解度低,易于使沉渣吸附于红细胞表面而影响计数;新亚甲蓝是WHO推荐使用的染液,其对网织红细胞染色较强且稳定。注意试剂应定期配制。
2.染色时间与室内温度有关,如室温低应延长染色时间或放置37℃温箱。
3.染液与血液的比例以1∶1为宜,严重贫血时可适量增加血液的比例。
4.制成的薄片质量严重影响计数结果的准确性,薄片应厚薄适宜、分布均匀、有头、体、尾三部分,无空泡,不使红细胞重叠。最好制2张片,每张计数1000个红细胞,避免分布不均引起的误差。
5.选择区域应为红细胞分布均匀、网织红细胞着色好的部位,且在最短时间内完成检测。
6.使用Miller窥盘计数法时,网织红细胞百分数不同,小方格内要求计数的红细胞数也不同,为了控制网织红细胞计数CV在10%之内,Miller窥盘计数法要求在连续视野中小方格内需要计数的红细胞数见表3-1。
表3-1 实际需要在小方格内要求计数的红细胞数
【技能要点】
1.严格按照操作步骤操作,动作熟练、迅速、规范。
2.染色和涂片质量。
3.选择网织红细胞计数区域适当、计数方法正确。
(李贵霞 李立新)
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