纸片扩散法抗菌药物敏感试验

【目的】掌握纸片扩散法抗菌药物敏感试验(K-B法)的原理、操作方法和结果判读。

【标本】大肠埃希菌(18～24h非选择性培养基上纯培养物)。

【试剂】营养肉汤或无菌生理盐水、直径为9cm水解酪蛋白(M-H)琼脂平板、药敏纸片(氨苄西林、头孢唑啉、庆大霉素、头孢曲松、环丙沙星、亚胺培南)等。

【器材】35℃培养箱、0.5麦氏比浊管或比浊仪、酒精灯、接种环、镊子、无菌棉拭子、毫米尺或游标卡尺等。

【操作步骤】

1.操作前准备:戴口罩、帽子、手套,穿工作服,准备并清点本试验所需器材。

2.菌液制备。用接种环或无菌棉拭子蘸取大肠埃希菌单个菌落,接种到有营养肉汤或0.9%无菌生理盐水的试管中,制成菌悬液,校正浊度为0.5麦氏浊度。制备好的菌悬液需在15min内接种至M-H琼脂平板。

3.细菌涂布。将蘸取菌悬液的无菌棉拭子在试管内壁旋转挤去多余菌液后,在M-H琼脂平板表面均匀涂布接种3次,每次平板旋转60°,最后沿平板内缘涂抹一周,盖上平板盖,置室温干燥3～5min。

4.贴片。用无菌镊子或纸片分配器将药敏纸片平贴于M-H琼脂平板表面(药敏纸片上的字朝上),轻压。直径9cm的平板可贴6张纸片,每张药敏纸片之间的距离≥24mm,距平板边缘≥15mm,纸片贴牢后不要移动。

5.细菌孵育。将贴好药敏纸片的M-H琼脂平板置室温干燥3～5min,倒置放入35℃培养箱中培养16～24h。

6.抑菌圈测量。用游标卡尺或毫米尺测定各药敏纸片的抑菌圈直径(在平板背面量取),并记录。

7.结果判读。根据CLSI标准报告细菌对抗生素是敏感(S)、中介(I)及耐药(R)。

8.每次试验均要进行标准菌株对照实验,标准菌株的抑菌圈应在预期值范围内。

9.操作后正确处理医疗垃圾,实验器材归回原位。

【注意事项】

1.备用的药敏纸片应储藏在-20℃冰箱。

2.工作用药敏纸片存储在4℃冰箱中,不能超过1个月。

3.M-H琼脂平板pH 7.2～7.4,厚度4mm。

4.测量抑菌环的大小应仔细。

5.每次试验时,质控菌种的抑菌环应在控制范围内。

6.M-H琼脂平板在培养箱内最好单独摆放,叠在一起不超过两个,否则夹在中间的平板达不到培养箱温度而产生预扩散。

7.整个操作过程须注意无菌操作和生物安全防护。

【技能要点】

1.准确校正菌悬液浊度。

2.菌悬液均匀涂布M-H琼脂平板,合理选择药敏纸片。

(张金艳　赵建宏)