积液标本的制作

采集到的积液标本应及时送检，接到送检标本也应立即离心处理，以保持标本的新鲜性。标本无需加固定液和防腐剂，因为经过固定处理的标本离心沉淀后因蛋白质凝固，与载玻片结合（粘着）度低，在染色过程中有可能掉片（使细胞脱离玻片），尤其是在免疫细胞化学染色时更易掉片。

送检的积液标本要求量愈多愈好，一般在100～500ml为宜。现介绍简单的MBW阶梯式沉淀离心印片法（以下简称MBW印片法，是笔者所在实验室常用的制片方法），供参考使用。将标本在阴凉处静置5min，轻轻倒去1/2左右；若多于100ml应再次静置5min，弃去1/2，直至50ml左右的自然沉淀标本，分别置于两个容量为50ml塑料离心管中。平衡后以2000r/min的速度离心5min左右，轻轻取出离心管至污水池中将离心管底朝上，彻底倒去上清液（若沉淀物量过多时则需轻轻倾斜离心管，缓缓倒去上清液，如上清液仍然显多，可再次离心处理）。采用镊子夹脱脂干棉球蘸取沉淀物，在玻片上轻轻印片，潮湿状态下（以竖起载玻片时涂抹物不流动为标志）置95%乙醇固定液中1～2h，进行染色。此法的优点是沉淀物量多和背景无液体遮盖细胞，因棉球将液体吸入内部，而棉球表面的大量细胞成分被印在载玻片上，其片薄而均匀，细胞数量多，结构清晰，背景干净（图1-5～图1-7）。

以下几点是制作一张好涂片的关键：送检标本必须抽吸后立即送检，接收标本后也要立即进行处理；标本量要求多，多涂片用于多种染色有助于确立诊断；液体标本内不加固定剂或防腐剂；阶梯式沉淀：自然沉淀和离心沉淀结合进行；彻底倒去上清液，剩余水分越少越好。沉淀物不能直接放在玻片上，采用棉球或泡沫塑料等具有吸水性的物体，将沉淀物中的剩余水分吸出，其表面则为附着的细胞成分；印片时动作要轻，避免挤压；玻片在潮湿状态下（竖起载玻片不能流动情况下）投入固定液，固定1～3h。固定的效果取决于关键的步骤，应使标本始终处于潮湿状态，不能使细胞长时间处于干燥状态，这样才能显示湿式固定的效果（图1-6、图1-7）。

图1-5　印片法操作

从经离心沉淀的离心管（完全倒去上清液）管壁上以脱脂棉签蘸取细胞直接在载玻片上印片（A），在潮湿状态时立即投入95%固定液中（B），2h后染色

图1-6　固定的效果

同一张涂片的不同部分，经不同状态固定的细胞结构，细胞已干燥处（A）固定后细胞与核着色淡，基本看不出核内结构；潮湿处（B）固定后核染色质着色适度，核内结构显示很清晰。MBW印片法制片（Pap×400）

图1-7　干式固定与湿式固定的效果

同一标本涂片干燥处（虚线三角区域）与潮湿处（右下）固定的不同效果：在显示核结构内容方面不同，右下图内核膜、核染色质以及核仁清晰，而虚线区内细胞核不能显示这些结构，而箭头所指的高核质比细胞就是肿瘤细胞。印片法制片（Pap×400）

涂片的数量一般在2～4张为宜，可分别做各种常规染色，若直接进行细胞化学染色或免疫细胞化学染色可适当多做一些涂片（图1-8～图1-10）。经上述步骤处理的标本，也可用于电镜取材，方法是用刀片切下或刮取约1/2的棉球蘸取的沉淀物，但不可带棉纤维，然后装入戊二醛固定液送检。

图1-8　分化好的腺癌的细胞学标本直接涂片的免疫细胞化学标记

在细胞量少的情况下，细胞形态“单一”，难以辨别其良恶性（A）；但因有腺癌细胞的核偏位特点，选择癌胚抗原（CEA）标记，表达阳性（B）（Pap×400；CEA×400）（宁夏医科大学附属第二医院病理科贾支红医师提供病例）

图1-9　直接涂片的免疫细胞化学染色

间皮细胞增生时可以出现成团的细胞，其平面感强（A，HE×400）；涂片经2h的固定，可直接在涂片上行免疫细胞化学染色（B，CK18×400），其效果与细胞块的标记不相上下

图1-10　直接涂片的免疫细胞化学染色效果

直接涂片上的免疫细胞化学标记的效果佳，少数反应性增生的间皮细胞可清晰显示核着色阳性（A），也容易计数（Ki-67×100）； HE染色片对照（B）（HE×400）

可以采用液基制片，标本由临床送达细胞学实验室。接到标本后立即按阶梯式沉淀离心，用持针钳夹棉球，将离心后棉球上的沉淀物用刀片刮去，置液基保存液中。立即送实验室制片机器制片即可（图1-11）。如有Cytospin细胞离心机，选用部分液体标本，可离心甩涂一次完成。

图1-11　胸腔积液标本液基法制片（模拟涂片截图）

涂片背景干净，细胞与细胞核结构清晰，图像反差大，即使放大倍数不大也能观察其中的形态表现。TriPath液基制片（Pap×400）