放射免疫法

一、简 介

放射免疫法是利用核素标记的与未标记的抗原,同抗体发生竞争性抑制反应的方法,研究机体对抗原物质反应的发生、发展和转化规律。美国女免疫学家雅洛,因创立了放射免疫法而荣获1977年诺贝尔生理学及医学奖。雅洛1921年生于纽约,父母都是犹太人,她从小酷爱自然科学。在大学里,她热衷于物理学,却致力于医学研究,她工作于纽约市布隆克斯区退伍军人医院,致力于《胜太荷尔蒙的放射免疫分析》。居里夫人自传和核子物理学家美籍意大利人费米的讲演,对她后来的事业产生了很大的影响。她渴望从事科学研究工作。然而,当时的美国,哪个大学也不同意将一笔物理学奖金给一个女人。她主动给一位杰出的化学家当非全日制秘书、由于工作出色,几个月后,伊利诺依大学给了她一份奖学金,并给了她一个助理研究员的位置。从1941-1945年,她把主要精力都用在三项活动上:教学、钻研高深课题和准备核物理博士论文。她于1945年获得博士学位。从1945年起,她边授课,边研究,边著书立说,并在勃隆克斯医院筹备和开发新的放射性核素应用工作。

在得奖之前的二十多年,雅洛便在一个偶然的机会,发现猪胰的胰岛素可用来治疗糖尿病,可以使病人产生抗体。这种发现与当时的治疗理论不太合适。因为治疗药物能引起抗体是不可思议的事,因此其发现并不为当时的人所接受。然而,这个发现却引导近代内分泌学的研究进入了新的境界,更由此而推展,使得已往不易测定的身体中的物质得以测定。这个方法就是放射免疫测定法,(radioimmunoassay,RIA)。

二、反应原理

这称之为放射免疫测定法的方法是怎么一回事呢?先把名字拆开来看一看,放射-免疫-测定法,这里头有两个葫芦,第一是放射,也就是有放射性的东西,第二是免疫,有抗原抗体关系的事情。

先讲免疫这个葫芦。大家都打过预防针,打针的目的多半是使身体可以产生一种抗体。至于如何预防离题太远,略去不谈。多数蛋白质的异物叫抗原,都能使动物产生抗体,而这种抗体十分特异,就是说一种抗原多半只能引起一种抗体,而且多半只能与一种抗体结合。比较容易理解的说法是,一种抗体只“认得”一种抗原,实验证明,抗体也“认得”带有放射性的抗原,这就是另外一个葫芦,有放射性的抗原。

由上面的叙述,可知放射免疫测定法的方法至少有3件东西;第一,抗体;第二,有放射性的抗原;第三,无放射性的抗原。当这三样东西放在一起,在某一种特定的环境下,抗体便开始与抗原结合,根据质量定律,这种作用会达到平衡。平衡的时候,抗体上结合的有放射性的抗原与没有放射性的抗原的量成反比。换句话说,在一定的体积中,一定量的抗体和一定量的有放射性的抗原,加入无放射性的抗原愈多,结合在抗体上的有放射性的抗原愈少。这样,若是能够把结合有抗原的抗体和无结合的抗原分开,然后以测定放射性的方法,测这些抗体的放射性,就可以推算出有多少不具放射性的抗原了。

放射免疫测定法将放射性的灵敏度与免疫的特异度融合于一炉,既简便准确又灵敏可靠;刚开始时是为胜太荷尔蒙设计的定量法,已推广到一些药物及环境中一些毒素的微量定量,真是功德无量。

原理使放射性标记抗原和未标记抗原(待测物)与不足量的特异性抗体竞争性地结合,反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。用反应式表示为:Ag*+AbAg*·Ab +AgAg·Ab

式中Ag*为核素标记的抗原,与未标记的抗原Ag有相同的免疫活性,两者以竞争性的方式与抗体Ab结合,形成Ag*-Ab或Ag-Ab复合物,在一定反应时间后达到动态平衡。如果反应系统内加入的Ag*和Ab的量是恒定的,且Ag*和Ag的总和大于Ab有效结合点时,则Ag*-Ab生成量受Ag量的限制。Ag增多时,Ag-Ab生成量也增多,反之Ag*-Ab生成量则相对地减少。因此,Ag*-Ab与Ag的含量呈一定的函数关系。如采用一种有效的分离方法,将Ag*-Ab和Ag-Ab复合物(以B表示)与Ag*-Ag(以F表示)分离,并测定B和F的放射性,可有以下规律:如样品中Ag增多,则B的放射性降低,F的放射性增高,即Ag与B成反比。计算B/F或B/T值(T=B+F),即可算出样品中Ag的含量。由于RIA是以放射性标记与非标记抗原竞争性地与抗体结合为理论基础,故又称为竞争性放射饱和分析法。

测定方法为分别在一定数量的试管中加入不同浓度的标准抗原(或未知样品),每管加入等量的放射性标记抗原和一定量的抗体,在4℃或37℃下保温,待反应平衡后,选用适当的方法将B和F分离,测量放射性强度,由放射性强度比B/T对Ag量制出标准曲线,即可从标准曲线上查出未知样品量。

测定时,首先要制备出纯的抗原和抗体。凡能刺激机体产生抗体,且与抗体发生特异性结合反应的物质通称为抗原,例如,蛋白质(细菌、病毒、异种血清等)。只有反应原性而无免疫原性的物质称为不完全抗原或半抗原,如多糖、类脂和一些小分子物质。可用化学方法把一些半抗原与载体(蛋白质的大分子)结合而获得免疫原性,这种结合为RIA开辟了广泛的应用范围。常用的载体有γ球蛋白、纤维蛋白质、鸡卵蛋白、血蓝蛋白和各种甲状腺球蛋白。半抗原结合载体是由半抗原的功能基团与载体功能基团所决定,一般连接后不应引起半抗原结构改变,也不使载体蛋白变性。常用结合载体的方法有混合酸碱法、水溶性的羰二亚胺法等。

抗体是能与相应抗原或半抗原专一地结合的免疫球蛋白分子。应用免疫技术可以获得特异性的抗体。抗体的敏感度范围由其特异性和亲和力决定,测定时所用的抗体稀释度越低,则加入的量越多,测定的敏感度越低,可测范围越宽。如加入抗体量少,则测定的敏感度提高,可测范围变窄。一般在选定标记抗原用量后,即可根据测定要求来选择合适的抗血清用量。

常用于标记抗原的放射性同位素有H、I等,H可以置换有机化合物中的氢,且不影响原有化学性质。H半衰期长,能量低,便于防护,常用的标记化合物有H环磷酸鸟苷,H环磷酸腺苷,H睾酮等。I和I原子的化学性质比较活泼,标记方法简便,不论多肽、蛋白质或小分子半抗原均可进行碘标记。有些半抗原不能直接用碘标记,常常接上一个酪氨酸再以碘标记,以减少标记抗原免疫化学活性的损失。常用的偶联试剂有碳化二亚胺类、烷基氯甲酸酯类、二异氰酸盐类及亚氨酸酯等。

三、应用领域

将此法用于内分泌学测定胰岛素、生长激素、甲状旁腺激素、血管紧张素、催乳素、黄体化激素、促卵泡成熟激素、前列腺素等,以鉴别、诊断、研究激素的生理和药理作用,目前较多用于研究激素与受体结合的机制。在传染病学方面,广泛用于乙型肝炎抗原的亚型分类测定。在临床免疫学上测定免疫球蛋白G、免疫球蛋白E及抗脱氧核糖核酸抗体;进一步的应用包括甲状腺球蛋白抗体、类风湿因子、补体及抗食物抗原抗体的测定。在肿瘤学方面用于测定癌胚抗原、血纤维蛋白溶酶原、叶酸、维生素B12以及血纤维蛋白原和血纤维蛋白降解产物。根据已建立的人绒毛膜促性腺激素、癌胚抗原和甲胎蛋白的RIA结果,为有效地初筛和在手术后追踪释放这些蛋白质的肿瘤提供了参考依据。在药理学方面可测定吗啡、氯丙嗪、苯妥英钠、庆大霉素、地高辛、茶碱等,是检测药物中毒和药物代谢的一个比较迅速和简便的方法。

优缺点:RIA法的优点是灵敏、特异、简便易行、用样量少等,常可测至皮摩尔。本法虽然也用放射性物质,但一般都是在测试样品时再加入标记的核素示踪物,此示踪物的放射性强度极低,一般不会对试验者引起辐射损伤。本法的缺点是有时会出现交叉反应、假阳性反应,组织样品处理不够迅速,不能灭活降解酶和盐及p H有时会影响结果等。

展望:在本法的基础上,近年来,又发展了其他免疫分析法,用其他有特殊性质的物质代替放射性核素来标记抗原,同样利用标记与未标记抗原与抗体竞争性结合,然后用适宜方法测定。其中研究较多的是荧光免疫分析,采用荧光化合物标记抗原,结合分离后通过荧光值的测定进行定量分析。

放射免疫法包括两个方面的技术:第一是生物学方面的,它利用特殊抗体的反应,甄别所给定的有机物质;第二是物理学方面的,它将有放射性的原子引入有机物质中,给这些有机物质打上记号。放射免疫法,是一种灵敏度高、较简便的测量法,几乎可测定生物体内任何物质,包括生物体本身分泌的各种激素,病人口服或注射的各种药物,一些病毒抗原等,已广泛用于临床常规检验。