羟脯氨酸测定

一、概 述

羟脯氨酸(hydroxyproline,Hpr)是脯氨酸的羟化物,在人类主要是以4-OH-Pro形式存在,而3-OH-Pro仅有少量存在。Hpr特异的存在于胶原中,占胶原总氨基酸量的11%～ 14%。胶原与其他蛋白质不同,是由3条多肽链,如绳索状旋转形成胶原螺旋。3个链的螺旋部分氨基酸序列由Gly-X-Y反复旋转构成,Gly为甘氨酸,X位置为脯氨酸,Y为羟脯氨酸,赋予胶原分子的稳固性和坚韧性。

胶原广泛分布于骨、皮肤、肌腱、软骨、动脉壁等具有坚韧性的组织中,约占机体蛋白质总量的1/3。胶原代谢产物Hpo尿排泄量,反映这些组织的胶原代谢动态,特别是骨代谢异常,因骨胶原占人体胶原的50%～60%,Hpr占骨胶原的13%,因而Hpr尿排泄量可作为骨代谢异常的指标。反映骨代谢的Hpr主要为4-OH-Pro,同时也可反映器官纤维化。3-OH-Pro是基底膜Ⅳ型胶原的构成成分,用于癌症筛查。

二、病人准备

1.药物 雌三醇可使Hpr代谢减慢。

2.饮食 为排除食物性胶原干扰,应禁食含胶原的食物,如肉类、明胶(皮冻)、果冻、冰激凌等,可用奶、卵等食物代替。

三、标本采集

1.采集时间 按上述食物禁忌,正常饮食。

(1)开始留取24h定量尿标本,加甲苯或叠氮钠防腐,记录尿总量,混合后取20ml送检或留取次晨第2次尿。

(2)采集静脉血于普通试管或肝素抗凝管中。

2.标本保存

(1)血清血液在室温自然凝固10～20min后,离心20min左右(2000～3000r/min),收集上清,如有沉淀形成,应再次离心。

(2)血浆应根据试剂盒的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,加入10%(v/v)抗凝剂(0.1M柠檬酸钠或1%肝素或2.0%EDTA-Na2)混合10～20min后,离心20min左右(2000～3000r/min),收集上清检测。

(3)尿液离心20min左右(2000～3000r/min),收集上清检测或保存。

(4)保存离心后的血清、血浆标本均应密封置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融, -20℃不应超过1个月,-80℃不应超过2个月;标本溶血会影响最后检测结果,因此,溶血标本不宜进行此项检测;尿标本加甲苯防腐于0℃稳定,当标本的p H下降到1～2时,于30℃可放置5d。

四、注意事项

1.尿Hpr排泄量通常在妊娠晚期与产后6～8d最高。

2.受食物成分、年龄等因素影响,年龄不同,骨代谢不同。

五、试验方法及正常参考范围

1.氨基酸自动分析仪法(automatic amino acid analyzer) 测定原理是利用样品各种氨基酸组分的结构不同、酸碱性、极性及分子大小不同,在阳离子交换柱上将它们分离,采用不同p H离子浓度的缓冲液将各氨基酸组分依次洗脱下来,再逐个以另一流路的茚酮试剂混合,然后共同流至螺旋反应管中,于一定温度下(通常为115～120℃)进行显色反应,形成在570nm有最大吸收的蓝紫色产物。其中的Hpr与茚三酮反应生成黄色产物,其最大吸收在440nm。这些有色产物对570nm、440nm光的吸收强度与洗脱出来的各氨基酸的浓度(或含量)之间的关系符合比耳定律,可与标准氨基酸比较作定性和定量测定。

2.酶联免疫分析法 用纯化的Hpr抗体包被微孔板,制成固相载体,往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的Hpr抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Hpr呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(值),计算样品浓度。

正常参考范围 (各方法测定的参考范围差异性很大,仅供参考!)

乳儿期最低:19～56mg/24h;青春期最高:63～180 mg/24h

成年男性:24.81mg/24h±7.32 mg/24h;成年女性:27.50mg/24h±3.73 mg/24h。成年人第2次晨尿0.003～0.015(Hpr/Cr比值),男性稍高。

六、临床意义

1.增多见于内分泌疾病(甲状腺功能亢进症、甲状旁腺功能亢进症、肢端肥大症);骨病(Paget病、骨软化症、佝偻病、骨肿瘤、骨转移癌、多发性骨折);先天性结缔组织病(Marfan综合征、成骨不全症);皮肤损害(大范围灼伤);其他(妊娠子宫回缩时、生长期)等。

2.减低见于甲状腺功能减退症、Cushing综合征、侏儒症、皮质类固醇使用时。

3.尿Hpr排泄率是120μmol/g肌酐,作为临界点诊断乳腺癌骨转移的有效性是77%。