纤维支气管镜在细菌性肺炎诊断中的应用

肺部细菌感染是临床上最常见的感染性疾病之一。即使在抗生素极为发达的今天,肺部感染性疾病仍是威胁人类健康的主要疾病之一。其发病率仍很高。根据20世纪末的资料,感染性疾病致死者约占全球人口死亡数的1/3,其中呼吸道感染(主要是肺炎)则居各类感染的首位。我国每年约有250万例发生肺炎,死亡12.5万人。居常见死因的第5位。而美国一年诊断肺炎病例达400万例,其中需要住院者约60万人,以肺炎作为主要死因者7.5万人,死亡顺位在各类死因中居第6位。相对我国肺炎患者数可能被大大低估了。与20世纪50-60年代以前相比,肺炎在许多方面发生了根本改变。由于大量抗生素、免疫抑制药、激素的应用及人口老化等因素,使易感者增加。各种创伤性检查和治疗技术也增加了感染机会。宿主构成的变化使条件致病菌感染和难治性感染大量增加。医院获得性肺炎(HAP)的发生率和病死率都很高,其中由于机械通气患者明显增多,呼吸机相关肺炎(VAP)也逐渐增多,已成为当今医学界相当棘手的问题。近20年来,耐药致病菌及其菌种不断增加,使经验性治疗更加困难。抗生素种类的日益增多,使其正确选用更加困难,同时也加剧了滥用抗生素现象。以上情况表明,只有认真开展病原学诊断的研究工作,提高病原学诊断的敏感性,才能指导临床医师正确治疗,减少用药的盲目性和滥用抗生素现象。同时准确的病原学诊断也是感染性疾病领域所有科研工作的基础。正常人口咽部分泌物中可达21个属200余种细菌,浓度高达1011~1012 cfu/ml。在用咳出痰标本做病原学检查时,由于该标本难免受到上述菌群的污染,给肺部感染性疾病病原学诊断带来极大困难。

(一)无创性取材技术

1.普通痰培养法 咳痰标本容易获得,不增加患者负担,始终作为一项常规检查,结果也有重要意义,但往往易受口腔中寄殖菌的污染,影响病原菌诊断的可靠性。但实验室技术的改进增加了该方法的可靠性。

(1)细胞学筛选法:来自病灶的标本含有大量的白细胞(WBC)和鳞状上皮细胞(SEC),根据WBC和SEC数目可以衡量标本的质量,筛选出合格的标本进行培养。一般认为每低倍镜视野SEC<10,WBC>25或WBC/SEC>5标本较为理想。符合上述标准的标本其培养结果的可靠性在40%~70%。

(2)洗涤培养法:由于唾液的污染存在于黏液脓性痰的外层,所以,将痰标本在灭菌生理盐水中振荡洗涤可减少污染发生。洗涤后的标本多只有一种细菌生长。洗涤不会使病原菌数下降,反而因污染菌的减少,病原菌数有明显的增加。在厌氧环境下洗涤可用于厌氧菌分离。该方法可提高培养的特异性,但标本量少或稀薄时不适于洗涤。

(3)定量培养法:在痰液中加入1/5量的20%N-乙酰半胱氨酸,研磨使之溶解均质化,以便于稀释和消除病原菌在痰中分布不均的影响。吸取液化痰液0.5ml,加入4.5ml生理盐水(或乳酸林格液)中,连续稀释6次(10-1~10-6)。再用0.01ml的定量白金耳采取各浓度标本分区涂于培养基上,长出菌落后计数某个合适浓度的菌落数,推算出每毫升痰液中的细菌数。其诊断准确率较高,若以106 cfu/ml为阳性界限值,其与保护性毛刷(PSB)技术比较,其敏感性为82%,特异性为83%。一般认为菌量≥107 cfu/ml可判定为病原菌,104~106 cfu/ml的检出菌应结合其他检查资料判定。但该方法不能用于厌氧菌分离,洗涤后定量培养效果可能更好,但操作繁琐费时。定量培养与其他取材技术的结合,可提高诊断的可靠性。

2.血培养 在除外了肺外感染的前提下,血培养阳性有可靠的病原学诊断价值,但敏感性低于20%。

3.相对于已建立人工气道的无创技术

(1)气管内抽吸物(ETA)培养:ETA定性培养的符合率40%,敏感性为82%~87%,特异性仅为27%,其优点取材方便,可用于指导最初的经验性抗生素治疗,但不适用于抗生素治疗反应的监测及作为停药指征。ETA定量培养的优点是较定性培养更利于致病菌和污染菌的区别,以分离细菌量≥106 cfu/ml为阳性界定值,与经纤维支气管镜引导支气管肺泡灌洗技术比较,敏感性为70%~100%,病原菌在94%的采集样本中能得到确认,但特异性仅为50%以下。

(2)保护性标本刷盲插取样法:应用保护性标本刷管经气管导管放入下呼吸道取分泌物标本,其病原学结果与经纤维支气管镜引导保护性标本刷和肺泡灌洗具有同样的诊断价值。

(3)间接支气管灌洗技术(NBL):该技术应用特制导管或无菌吸痰管,经气管导管注入20ml左右的生理盐水,回收灌洗液行定量培养,与经纤维支气管镜引导支气管肺泡灌洗技术比较,细菌量>107 cfu/ml为阳性界定值,其敏感性与特异性分别为74%和70%。该技术不需特殊器械,是一种有效的选择。

(二)有创取材技术

1.经皮肺穿刺吸引法 经皮肺穿刺吸引(PLA)获得肺标本的组织病理学诊断和培养,是诊断肺炎特异性最强的方法,曾经被视为“金标准”。但这种方法存在的主要问题首先是由于要取得感染部位的肺组织,因此其敏感性不高,无空洞病变的敏感性在50%左右,有空洞者敏感性可达80%;其次,该方法创伤较大,在大部分肺炎患者不可能采取,即使做活检或尸检,也不可能在肺炎的早期进行,而抗生素的初始治疗将影响组织病理学诊断和培养结果。目前偶用于厌氧菌、卡氏肺囊虫和某些真菌感染。

2.经气管穿刺吸引法 经气管穿刺吸引法(TTA)的方法是:用内径0.14cm,外径0.18cm套针经环甲膜穿刺,向气管腔内导入一聚乙烯导管,达隆突水平后负压吸引取材。分泌物较少时注入少许生理盐水诱发患者咳嗽,然后吸引取材。该方法的阳性率一般在80%以上,假阴性率约为1%。

(三)经纤维支气管镜取材技术

经纤维支气管镜取材创伤小,并可在直视下有选择地准确取材,有其独特的优越性。

1.直接吸引法和普通细胞刷刷取法 此为最先使用,也是最简单的方法,是经纤维支气管镜吸引管道吸引或用标准细胞刷刷取分泌物培养。由于纤维支气管镜在通过上呼吸道时其前端和吸引管道常被污染,故上述方法仍不可靠。用亚甲蓝标记志愿者口咽部,有80%的吸引检出标记物。

2.经气管插管取材法 为减少污染有学者曾试用经气管插管(TT)取材方法,即先插入TT,再经TT插入纤维支气管镜,用普通细胞刷刷取或回收冲洗液培养。根据TT内腔细菌培养结果推测,标本被污染的可能性<12.5%。但也有资料表明插入TT会延长操作时间,加重患者痛苦,增加唾液吸入机会,反使污染率增加,故很少使用。

3.经导管吸引和用带套管毛刷取材法 由于污染菌多存在于纤维支气管镜前端吸引孔周围,若不经纤维支气管镜吸引管道直接吸引,而插入另一导管吸引或用带外套管的细胞刷取材,可能会减少污染,污染率仍高达18%~60%。即使经双层套管吸引也不能完全避免污染,但可通过定量培养法来区别污染菌与病原菌。用单套管毛刷取材同样有46%~53%的污染率。因此,为有效地防止污染,还需采取进一步的保护措施。

4.经纤维支气管镜引导保护性标本刷技术 1979年Wimberley在体外比较了单套管或双套管毛刷、套管末端加保护塞或不加保护塞及加不同的材料保护塞所组成的7种取材方法,证明加聚乙二醇保护塞封闭远端管口的大套管取材毛刷防污染效果最好。聚乙二醇为一种无毒的蜡样物物质,遇热融化,冷却后凝固。进入下呼吸道后很快溶解,可随痰咳出。在模拟上呼吸道污染的体外试验中,双套管加聚乙二醇保护塞的方法13次均未检出污染菌,而其他方法的污染率在38%~100%。之后,许多学者采用了该方法,称之为保护性标本刷(PSB)。

(1)操作方法:术前30min给予阿托品0.5mg/苯巴比妥0.1mg,2%利多卡因10ml雾化吸入麻醉。

镜体插入段涂以1%利多卡因。纤维支气管镜到达气管中下端以后插入PSB,在直视下采取分泌物或将纤维支气管镜插到X线检查有病变的肺段支气管口处,将PSB伸至远端取材。取材过程需注意的事项有:①取材前不能进行吸引操作,也不能从活检孔追加麻药,前者可加重吸引管道的污染,后者可将进入活检孔和附着于纤维支气管镜末端的污染菌带至下呼吸道取材区域,增加污染机会;②PSB伸出纤维支气管镜末端1~2cm后再推出内套管,顶掉PSB末端的保护塞,尽量将保护塞丢弃到取材区域外,内套管再伸2cm,然后推出毛刷采集标本;③取材后将毛刷缩回到内套管中,内套管再缩到外套管中,将整体从纤维支气管镜中拔出。

(2)细菌学处理:将PSB从纤维支气管镜中拔出后,用75%乙醇擦拭消毒套管末端,然后再用无菌剪刀将毛刷以前部分套管剪掉,伸出毛刷后,剪掉毛刷置于含有1ml林格注射液或生理盐水的小瓶中,盖紧瓶盖,用振荡器振荡使毛刷中的标本脱离,并使之均匀化分布。用林格注射液或生理盐水连续100倍稀释2次,至10-2~ 10-4稀释度。取原液及两种稀释液各0.1ml接种于不同培养基上,长出菌落后根据菌落数及稀释度推算出原液中的菌量。

对于在收集标本时是否需要将毛刷剪掉,Marquette比较了机械振荡(剪下毛刷)与手法振荡(不剪毛刷),其结果并无显著差异,因而认为剪下毛刷的做法并非必要。这为取材工具的重复使用提供了证据。

(3)结果判定:一般认为支气管-肺感染患者每毫升炎性分泌物中的病原菌数为106~108 cfu。PSB的取材量为0.001~ 0.01ml,置于1.0ml液体中被稀释100~1000倍。因此,每刷分泌物可能采得的菌量为103~106 cfu,经过对健康志愿者和肺炎患者的对比研究发现,用PSB取材,未经有效抗生素治疗的肺炎患者菌量一般在106 cfu/ml以上,而下呼吸道有定植菌或污染菌的菌量<106 cfu/ml。因此,一般认为高于106 cfu/m1的分离菌可以确定为病原菌。混合感染或已应用抗生素治疗的患者原菌量可以<106 cfu/ml。危重住院患者、慢性支气管炎缓解期、支气管扩张感染控制后、肺癌等支气管有阻塞性改变的患者,下呼吸道常有少量细菌定值,菌量也在106 cfu/ml,当然PSB也并非能绝对避免污染,因此,菌量在106 cfu/ml以上的细菌也有污染菌的可能。

该技术的准确性可因研究群体、肺炎定义标准、参照技术的可靠性及是否预先使用抗生素等而差异很大,在未使用抗生素的情况下,其特异性可达90%,但敏感性仅为40%~50%,这与其取材区域小,获取分泌物量少有关,如果预先使用了抗生素,其敏感性可低至13%,可能原因:一是污染,二是抗生素的大量应用,使耐药细菌定植有关。

5.经纤维支气管镜引导支气管肺泡灌洗技术 支气管肺泡灌洗技术很早就被用于肺部感染的病原学诊断上。因灌洗液可直达远端肺实质,较PSB采集标本的区域扩大,所以可能获得于PSB所不能达到的肺实质病灶的标本。由于肺泡的表面积远大于其引流支气管的表面积,因此,BAL能获取更多的分泌物。PSB的取材量在0.001~0.01ml,BAL回收液中至少含有1ml的下呼吸道分泌物,是前者的100~1000倍。因此,其敏感性更强。尽管如此,由于存在呼吸道寄殖菌的污染,使BAL液中含有大量污染菌,影响了特异性,因此过去仅用于机会性感染,随着保护性支气管肺泡灌洗技术(PBAL)的应用,有效地避免了上呼吸道菌群的污染,该技术被广泛采用。

(1)器具:PHAL所用的器具称作远端带气囊的保护性导管,简称PBT导管。它是由不透过X线的polyurethane制成,外径2.3mm,适用于吸引孔径为2.6mm的纤维支气管镜。它有两个管腔,一个大腔直径为1mm,用于注入和回收灌洗液。另一个小腔通向远端的高顺应性、低压乳胶气囊,该气囊为l2mm长,注入1.5~2.0ml气体后外径增至10~12mm,可以牢固地封闭第三级支气管。

(2)操作方法:取材前不经纤维支气管镜吸引管道吸引和注入利多卡因追加麻醉。纤维支气管镜达到取材区支气管后插入PBT导管,伸入欲取材的亚段,向气囊内注入1.5~2.0ml气体,使气囊充盈,封住该亚段支气管腔。轻轻提拉导管,以确认是否封闭牢固。然后通过灌洗腔道注入2ml无菌生理盐水,冲掉其远端的聚乙二醇塞。用5份30ml的无菌生理盐水进行灌洗。丢弃第1份回收液,分装其他回收液用于需、厌氧菌定量培养及Gram染色和Giemsa染色。

(3)实验室处理:将PBAL回收液(BALF)振荡30s,稀释为10-1、10-3、10-5三个稀释度,接种于不同培养基上。取原液0.5ml用于Giemsa、Gram染色,以检查细胞内微生物。

(4)结果判定:一般认为BALF中下呼吸道分泌物被稀释100~1000倍,因此,BAL的阳性界值定为107 cfu/ml,与PSB的106 cfu/ml的判定标准是一致的,其敏感性特异性为50%~90%。其阴性培养结果对确认无菌肺组织的敏感性为63%,特异性为96%,因此对除外肺炎诊断有重要价值。在支气管炎和有严重气道细菌寄殖的慢性阻塞性肺疾病患者,其特异性明显降低,假阳性率升高,如果预先使用抗生素,其诊断可信度显著降低。

(5)BALF的显微镜检查:取BALF中脓性分泌物涂片、Gram染色,镜下观察的阳性标准为:①多形核白细胞>25个/每视野×100;②鳞状上皮细胞<1%/每视野×100;③微生物≥1个/每视野×1000。与BAL定量培养平行研究显示,其敏感性为77%,特异性为87%,阳性和阴性预计值分别为71%和90%。如果BALF中白细胞<50%,有100%的组织学肺炎的阴性预计值。

6.对经纤维支气管镜引导PSB、BAL技术的评价 社区获得性肺炎(CAP)患者大部分免疫功能正常,致病菌耐药率低,经验性抗生素治疗效果良好,因此往往不需要更深入的细菌学调查。但对于一些对初始抗生素治疗失败且合并有慢性疾病,如慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、营养不良、肿瘤,以及误吸的患者,对确定特异致病菌,则需要应用经纤维支气管镜取材技术。Rasmussen对67例CAP患者进行BAL,其定量培养以107 cfu/ml为阳性界定值,特异性为100%,显示了较好的致病菌的诊断特异性,但敏感性为35%。然而,经纤维支气管镜取材技术的应用能否对患者的预后产生影响还不能肯定,Rasmussen在同一研究中,虽然88%的患者根据BAL结果选择或调整了抗生素治疗,但病死率仍达到15%。而Jimenez的研究则显示,对于CAP患者BAL结果与咽拭子定量培养的结果具有很好的相关性,提示BAL结果与咽拭子定量培养有类似的准确性。

对于医院内获得性肺炎致病菌的确定可指导治疗,减少不正确、不必要的延迟经验性治疗,缩小抗菌谱,减少耐药菌株的产生,避免过度使用抗生素。经纤维支气管镜取材技术,尤其保护性设计(PSB、BAL)结合定量培养,减少了取样时的污染,可区分致病菌和污染寄殖菌。通过对PSB、BAL的研究和应用,也证实了该技术具有相当的准确性、可重复性,能指导治疗的调整,但因设备、技术和不良反应的限制,难于常规使用。近年来,对HAP病原学诊断技术的评价已从技术本身的优劣评价进展到评价技术的应用对包括病死率、效价比及耐药率等对患者预后的影响。

以上研究还显示,初始治疗是否适宜、内外科患者群体和致病菌的差异对HAP患者预后有影响。纤维支气管镜检查的局限性可能在于:①其对治疗有价值的结果得到的太迟;②其他简便的痰样本培养可以提供与其类似的病原学依据;③重复的检查常可分离出一些高耐药细菌,诸如多耐药的铜绿假单胞菌,而抗生素清除这些耐药致病菌是很困难的。