胶原纤维是结缔组织纤维的一种,粗细不一,直径为0.5~10μm,具有韧性大和拉力强的特点。胶原纤维分子根据其生化成分可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型,其中Ⅰ型胶原纤维多分布在真皮、韧带、肌腱和骨;Ⅱ型胶原纤维主要分布在透明软骨;Ⅲ型胶原纤维分布在真皮、血管和胃肠等;Ⅳ型胶原纤维主要分布在基底膜。
常用的胶原纤维特殊染色方法有Van Gieson法、Masson法、Mallary法等。
(一)Van Gieson(VG)染色法
1.试剂配制
(1)Weigert苏木素。A液:苏木素(haematoxylin)1g加入无水乙醇100ml;B液: 30%三氯化铁(ferric chloride)4ml加入蒸馏水95ml,再加纯盐酸1ml。
(2)Van Gieson液。A液:酸性品红(acid fuchsin)1g加入蒸馏水100ml;B液:苦味酸(picric acid)饱和水溶液:苦味酸1.2~2.0g加入蒸馏水100ml。临用前将A液、B液按1∶(7~9)混合,即配即用,不宜保存。
2.操作方法(以下方法中,如无温度特别说明,实验温度均为室温)
(1)切片脱蜡至水。
(2)Weigert苏木素染色20min。
(3)水洗,必要时1%盐酸乙醇分化1~2s。
(4)流水冲洗10min,蒸馏水稍洗。
(5)Van Gieson液染色1~2min。
(6)直接95%乙醇快速分化至洗去VG染液。
(7)无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
3.染色结果 胶原纤维:鲜红色;肌纤维:黄色;红细胞:黄色;细胞核:蓝黑或灰色。
4.注意事项
(1)Weigert苏木素必须在使用前用Weigert苏木素A液和B液等量混合配成,几个小时内用完,放置时间最长不能超过24h。
(2)苏木素(包括Weigert苏木素)配制20多天后才能使用,必须提前配制;该液能抵抗弱酸性染液对已着染细胞核的作用,颜色不易被脱去,如未特别深染,无须分化。
(3)苦味酸水溶液的饱和度约为1.2%,因其含水所以可加至2g,要达到过饱和,才能吸取上清液使用。
(4)VG染液染色后,如果用水冲洗,会脱色或颜色不鲜艳,所以用95%乙醇直接快速分化至洗去VG染液。
(二)Masson三色染色法
1.试剂配制
(1)天青石蓝液配制:天青石蓝(Celestin blue B)1.25g,硫酸铁铵(ferric ammonium sulfate)1.25g,蒸馏水200ml与甘油(glycerin)30ml。将前两者溶于蒸馏水后煮沸,冷却后过滤,再加入甘油和麝香草酚,备用。
(2)Mayer苏木素配制:苏木素0.1g、蒸馏水100ml、钾明矾(potassium alum)5g,柠檬酸(citric acid)0.1g与水合氯醛(chloral hydrate)20mg。苏木素放入蒸馏水用玻璃棒不停地搅拌直至完全溶解,依次加入钾明矾、柠檬酸及水合氯醛,继续搅拌,最后加入碘酸钠,搅拌均匀,备用。
(3)丽春红酸性品红液配制:丽春红(ponceau 2R)0.7g,酸性品红(acid fuchsin) 0.3g,冰醋酸1ml与蒸馏水99ml。
2.操作方法
(1)切片脱蜡至水。
(2)用1%高锰酸钾氧化切片5min。
(3)水洗,草酸漂白1min。
(4)水洗,蒸馏水洗,天青石蓝液染色5min。
(5)甩去余液(不用水洗),滴染Mayer苏木素染色3~5min。
(6)流水冲洗5~10min。
(7)丽春红酸性品红液滴染5min。
(8)用1%醋酸水溶液洗片。
(9)用1%磷钼酸分化5min。
(10)蒸馏水洗片。
(11)用1%淡绿或2%甲苯胺蓝滴染30s。
(12)用1%醋酸水溶液洗片。
(13)用95%乙醇分化,无水乙醇脱水。
(14)二甲苯透明,中性树胶封固。
3.染色结果 胶原纤维:绿色或蓝色;细胞核:灰黑或灰蓝色;肌纤维、细胞质、红细胞:红色。
4.注意事项
(1)各染液配制后保存时间不能过长,最好每次染色前配制。
(2)切片在乙醇中脱水的时间不可过长,否则会脱去已着颜色。
(3)切片随着时间推移颜色会逐渐褪去,保存最长为1~2年。
(4)磷钼酸与磷钨酸在染色中的作用不同,磷钼酸作用于胶原纤维。
(5)如固定用Zenker固定液,染色效果会更好。
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