网状纤维是结缔组织纤维的一种,由网状细胞产生,直径0.2~1.0μm,有分支,相互交织成网,与网状细胞构成网状组织,主要分布于造血组织和淋巴组织,如肝、脾、淋巴结等器官和结缔组织与其他组织交接处,如基膜等。观察网状纤维的变化,如增多、减少、断裂等有助于判断组织结构,特别是癌与肉瘤的鉴别诊断。网状纤维染色方法(银染法)有改良Gomori法、改良Godon-Sweet法、Wilder法、Foot法等。
(一)改良Gomori法
1.试剂配制
(1)Gomori银氨液配制:取10%硝酸银液3份,加入10%氢氧化钾1份,混合后产生大量黑色沉淀,倒去表面液体,保留沉淀物,加入10倍以上蒸馏水冲洗3次,至沉淀物清晰即可。缓慢滴入浓氢氧化铵溶液,使沉淀物溶解,到沉淀物剩少数几粒时,取10%的硝酸银液逐滴加入,使溶液稍变浑浊,缓慢滴入浓氢氧化铵溶液,使溶液变清,用蒸馏水稀释10~15倍,即可使用,可置于4℃冰箱保存。
(2)4%甲醛溶液配制:浓甲醛(40%)10ml,90ml蒸馏水加入碳酸钙至过饱和。
2.操作步骤
(1)切片脱蜡至水,蒸馏水洗。
(2)0.25%高锰酸钾液氧化5min。
(3)自来水洗,蒸馏水洗。
(4)用2%草酸水溶液漂白1~2min。
(5)自来水洗,蒸馏水洗。
(6)用2%硫酸铁铵媒染5min。
(7)自来水洗,蒸馏水洗。
(8)滴加配制好的Gomori银氨液浸染3~5min。
(9)蒸馏水洗,数次。
(10)用4%甲醛液还原1min。
(11)自来水洗2min,蒸馏水洗。
(12)自来水洗10min,蒸馏水洗,各级乙醇脱水。
(13)常规透明,中性树胶封固。
3.结果 网状纤维:黑色;细胞核:棕黑色;胶原纤维:黄至黄棕色。
(二)改良Gordon-Sweets银氨法
1.试剂的配制
(1)酸化高锰酸钾液配制:临用前将0.5%高锰酸钾液与0.5%硫酸液等份混合,即配即用,不能保存。
(2)Gordon-Sweets银氨液配制:将浓氢氧化铵溶液逐滴加入到2ml的10%硝酸银水溶液中,出现沉淀后继续加入浓氢氧化铵溶液,至沉淀物溶解。加入2ml 3%氢氧化钠水溶液,即可产生沉淀,再逐滴加入浓氢氧化铵溶液至沉淀再度溶解,加入蒸馏水35ml,即可使用。平时置于4℃冰箱保存,可保存1个月。
(3)核固红液配制:分别用蒸馏水30ml和蒸馏水70ml完全溶解核固红0.1g和硫酸铝5g,再将两液混合,最后加入麝香草酚50mg,室温保存备用。
2.操作方法
(1)切片脱蜡至水。
(2)酸化高锰酸钾氧化5min。
(3)自来水洗,蒸馏水洗。
(4)用2%草酸漂白1~2min。
(5)自来水洗,蒸馏水洗。
(6)用2%硫酸铁铵媒染切片10min。
(7)蒸馏水洗。
(8)滴加配制好的Gordon-Sweets银氨液浸染2min。
(9)蒸馏水冲洗数次。
(10)用4%甲醛还原2min。
(11)自来水洗,蒸馏水洗。
(12)核固红液染细胞核5~10min,稍水洗。
(13)脱水,透明,中性树胶封固。
3.结果 网状纤维:黑色;细胞核:红色;胶原纤维呈黄至黄棕色。
(三)Wilder法
1.操作方法
(1)切片脱蜡至水。
(2)用1%高锰酸钾氧化5min。
(3)流水洗,蒸馏水洗。
(4)用2%草酸处理1~2min。
(5)流水洗,蒸馏水洗。
(6)用1%硝酸铀10s。
(7)蒸馏水洗。
(8)氨-银溶液浸染1min。
(9)用95%乙醇速洗。
(10)显影液内显色1min。
(11)蒸馏水洗。
(12)用0.2%氯化金调色1min。
(13)蒸馏水洗。
(14)用5%亚硫酸钠处理1~2min。
(15)自来水洗,蒸馏水洗。
(16)核固红复染。
(17)常规脱水,透明,封固。
2.结果 网状纤维:黑色;胞核:红色;胶原纤维:不着色。
(四)Foot法
1.操作方法
(1)切片脱蜡至水。
(2)用1%过碘酸水溶液氧化5min。
(3)自来水洗,蒸馏水洗。
(4)用4%硫酸铁胺水溶液媒染5min。
(5)自来水洗,蒸馏水洗。
(6)氨银液中,56℃烤箱内浸染40~60min,至切片呈黄棕色。
(7)速用蒸馏水洗。
(8)用4%甲醛5min。
(9)流水洗,蒸馏水洗。
(10)用0.2%氯化金水溶液调色1~2min,镜下观察至网状纤维呈黑色清晰,背景为灰白色止。
(11)自来水洗,蒸馏水洗。
(12)用5%硫代硫酸钠固定切片1~2min。
(13)自来水洗,蒸馏水洗。
(14)核固红复染。
(15)脱水,透明,封固。
2.结果 网状纤维:黑色;胞核:红色;胶原纤维:不着色。
(五)注意事项
1.银染色系化学反应过程,要求所使用的试剂、溶液及器皿洁净,以免杂质与银发生化学反应,所用试剂也最好用双蒸馏水配制。
2.配制氨银溶液时,氨水必须新鲜,以免滴加过量,这是染色成败的关键,操作中应边加边摇动,使沉淀物溶解至肉眼仅能见到一些微粒为止,氨水最好放冰箱保存,配好后的氨银液很敏感,受光或空气作用后易解离析出银盐,故宜用棕色玻璃瓶盛装并密封避光保存,一般置于冰箱可保存数天至数周。
3.切片经氨银液作用后水洗时间要恰当,时间过长会减弱银的还原性,网状纤维不够黑,时间过短又会使银的还原不够均匀,一般以数秒为宜。
4.甲醛还原所用浓度与时间,一般用4%的甲醛处理2次,每次3~5min即可,氧化时间不能过长,过长可使切片脱落。
5.组织固定一般用中性甲醛液为宜,不可采用含汞盐和四氧化锇的固定液,否则会导致切片内非特异性银沉淀。
6.染色前后蒸馏水冲洗必须充分,否则还原后的银颗粒会沉淀在组织上,切片脱水后应及时封固,以免产生色素颗粒,氯化金调色和硫代硫酸钠固定的时间不应太长,否则会出现网状纤维褪淡现象。
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