非特异性染色的消除

组织非特异性染色产生机制复杂,主要有:抗体以外的血清蛋白或组织成分与荧光素非特异性结合、抗体不纯混杂有游离荧光素或标记荧光素过多、荧光素不纯、标本固定不当等。消除非特异性免疫荧光的常用方法有:用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭组织切片、选用纯度好的荧光标记抗体(或抗原)、伊文蓝(Evan blue)衬染(衬染方法:用含0.01%伊文蓝的0.01mol/L p H7.2的PBS溶液稀释荧光抗体,可将背景细胞和组织染成红色荧光,与特异性黄绿色荧光形成鲜明对比,减少非特异性荧光,该方法亦可常规使用。伊文蓝可先配成1%溶液,4℃保存,用前再稀释到应用浓度)等。

为保证免疫荧光组织化学染色的准确性,实验过程中应同时进行对照试验,以便确定染色结果的特异性。

(一)常用对照试验

1.标本自发荧光对照 标本只加PBS或缓冲甘油封片,荧光显微镜观察,如果组织内仍有荧光,称为自发荧光。

2.抑制试验 分为一步抑制和两步抑制实验,直接法可直接进行抑制试验,间接法和补体法应先将第一抗体灭活再进行抑制试验。

(1)一步抑制试验:先将荧光标记抗体与过量未标记荧光特异性抗体等量混合,再将混合液滴加在标本上染色,结果应阴性。

(2)二步抑制试验:标本先加未标记荧光的特异性抗体,水洗后再加标记荧光的抗体,结果应阴性或荧光强度明显减弱。

3.荧光抗体对照 标本只加间接荧光抗体,结果应阴性。

4.补体对照 取新鲜豚鼠血清1∶10稀释后先与标本作用,洗净后再加抗补体荧光抗体染色,结果应阴性。

5.灭活补体对照 按补体同样稀释倍数将已经56℃、30min灭活的补体与抗体等量混合滴加到标本上,结果应阴性。

6.阳性对照 用已知阳性标本做免疫荧光组织化学染色,结果应阳性。

(二)染色结果特异性判定

1.直接法特异性染色判定 选用对照实验1、2、6,如对照实验1、2结果阴性,对照实验6和待测标本阳性,则为特异性阳性荧光。

2.间接法特异性染色判定 选取对照实验1~3、6,如对照实验1~3结果阴性,对照实验6和待测标本阳性,则为特异性阳性荧光。

3.补体法特异性染色判定 选取对照实验1~6,对照实验1~5结果阴性,对照实验6和待测标本阳性,则为特异性阳性荧光。