生物超薄切片制作

透射电镜的电子束穿透能力较弱,不能穿透普通光镜标本切片,普通光镜标本切片当然也就不能用于电镜观察。用于电镜观察的只能是超薄切片(厚度为10~100nm)。合格的超薄切片是获取理想超微结构形态的基础。

(一)超薄切片制备

超薄切片制备方法与光学显微镜石蜡切片的制作方法相似,但电镜分辨率高,在清楚显示样品微细结构的同时,也易暴露切片的人为损害、污染及变形。超薄切片制备要比普通光镜切片制备技术要求更加精细、复杂,操作者必须严格遵守操作规程。

1.取材

(1)取材方法:组织离体前,先将冰块放入玻璃平皿,冰块上放一块牙科蜡板,在蜡板上滴加少量组织固定液。组织离体后立即放入蜡板上的固定液,然后肉眼观察标本,确定待取部位。在0~4℃温度条件下,用锋利刀片双刀拉切法切取样品,每块样品体积约1mm× 1mm×1mm,最后放入盛有足量固定液瓶中固定。胚胎、脑等柔软易碎组织可先切取稍大的组织块放入固定液,固定1min后,再切成1mm×1mm×1mm大小样品块,放入固定液继续固定。

(2)注意事项:为使细胞结构尽可能保持生前状态,取材应注意以下要点。①快:取材动作要迅速,组织从活体取出后应在最短时间内(争取在1min内)浸入固定液;②准:取材部位要准确,取材者在取材前必须熟悉所取组织结构,尽量取到所需部位;③轻:操作轻柔,解剖器械及切取用道具必须锋利,以尽可能减少人为损伤;④小:所取样品体积一般不超过1mm×1mm×1mm,以保证固定液渗透充分;⑤冷:操作要在低温(0~4℃)条件下进行,以降低酶活性,减少其造成的细胞结构破坏。

2.固定

(1)组织块固定:亦称浸泡固定。将组织块浸入固定液固定,常用的是戊二醛-锇酸双重固定法。这能发挥两种固定液各自优点,使细微结构保存的更好。具体操作方法如下。①前固定(或预固定):在0~4℃条件下,用2%~4%戊二醛固定液(磷酸缓冲液或二甲砷酸钠缓冲液配制)或2%多聚甲醛+2%戊二醛混合固定液固定2~4h,固定液量至少应为标本体积的40倍;②缓冲液漂洗:在0~4℃条件下,用配制固定液的缓冲液漂洗,时间为0.5 ~2h或过夜,漂洗期间应至少换液3次。戊二醛固定时间越长,漂洗时间也应越长,以彻底洗脱戊二醛;③后固定:在0~4℃条件下1%锇酸固定液固定1~2h,而后用缓冲液漂洗20min,再行脱水。

(2)游离细胞固定:适用于培养细胞、周围血、骨髓、胸腔积液、腹水或其他液体。具体操作方法是:样本2~4ml置于试管中,1500~2000r/min离心10~15min;待样品在离心管底部凝结成块后,用吸管吸去上清,沿管壁缓慢加入2%~4%戊二醛固定液,静置30min,4℃冰箱保存。如样本为血液或骨髓,用细针小心将红细胞上面的淡黄色薄层膜(含白细胞及血小板)取出,并切成小块。

(3)原位固定法:是指在保持器官血液供应的情况下,边解剖边将固定液滴加到被取器官上,直至组织达到适当的硬度,再取出所需组织,然后按固定组织块的常规双重固定法固定。该方法适用于脑、眼睛、睾丸等柔软、易碎组织的固定。

(4)灌注固定法:这是目前公认的最好固定方法,即通过血液循环将固定液灌注到需要固定的组织中,将组织固定,其优点是灌注快速、均匀、组织结构保存好,缺点是操作复杂、技术要求高。常用灌注液为2%~4%戊二醛或4%多聚甲醛,也可为两者混合液。选择到达要取材器官的最短循环途径,将固定液经动脉或静脉插管灌注(也可用注射针刺入心室或主动脉推注)。灌注时间一般为10~15min,灌注速度为5~10ml/min,但要视具体情况而定。待被灌流组织硬化适度后,细致解剖取材,然后用常规双重固定法固定。

3.脱水

(1)方法:常用脱水剂是丙酮或乙醇,前者更常用。操作方法如下。组织块经50%、70%、80%、90%丙酮各10min,100%丙酮2次,共10min依次脱水。游离细胞脱水时间应适当缩短。过度脱水不仅会使更多的物质抽提,还会使样品变脆,造成切片困难。

(2)注意事项:①脱水过程应按梯度进行,禁止逆转。逐级提高脱水剂浓度,每一级脱水时间取决于组织标本的种类和大小,一般不要超过15min。②脱水一定要彻底,尤其是纯脱水剂不能含水分;可事先加入吸水剂(无水硫酸钠、无水硫酸铜等)进行吸水处理。③如果当天完不成浸透、包埋,样品应停留保存在70%脱水剂中,4℃过夜。④更换脱水剂要动作迅速,尤其换100%脱水剂,更要注意样品块在空气中停留时间不要过长,否则会使样品干燥,其内产生小气泡,造成包埋剂浸透困难。潮湿季节样品在空气中暴露时间过长会吸水受潮。⑤由于锇酸能与乙醇作用生成沉淀,所以在脱水之前,要用缓冲液将锇酸清洗干净,洗涤时间为10~30min或过夜。

4.浸透 将充分脱水的组织块依次浸入以下溶液。

(1)脱水剂与包埋剂混合液1(纯丙酮∶树脂包埋剂=1∶1),室温,1h。

(2)脱水剂与包埋剂混合液2(纯丙酮∶树脂包埋剂=1∶2),室温,2h。

(3)纯树脂包埋剂,室温,3h以上或过夜。

5.包埋

(1)方法:常规包埋在一次性包埋胶囊或特制橡胶模板中完成。首先将胶囊置烤箱中烘干,用小镊子或牙签将已充分浸透的组织块置入装满包埋剂的胶囊,依次在37℃、45℃烤箱内各聚合12h,再在60℃烤箱内聚合24h。常用的包埋剂是环氧树脂(进口的Epon 812、国产的618)。

(2)注意事项:①所有试剂均应防潮,存放于干燥器;②浸透、包埋用的注射器、吸管、烧杯、胶囊、牙签等用具在使用前均应烘干;③配包埋剂时,每加一种试剂都要搅拌均匀,建议每次混匀至少用玻璃棒搅动20min;④包埋时动作要轻,防止气泡产生;⑤操作过程中避免包埋剂接触皮肤、造成损伤;⑥容器盛放包埋剂后应及时用丙酮清洗干净。

6.切片制作 超薄切片是指将固化包埋块在超薄切片机上切成厚度为50~70nm薄片的过程,是制样的中心环节。

(1)准备:超薄切片前必须制备半薄切片(制片方法见后),光镜下观察,确定待制超薄切片部位,并将包埋块在解剖显微镜下用单刃刀片修成凸“点”,“点”面积约0.3mm× 0.3mm。同时还要进行选择和清洗载网、制备支持膜、制备玻璃刀、制备包装玻璃刀水槽等准备工作。

(2)步骤:切片步骤如下。①将已修好的包埋块安装到托架上,注意务必夹紧,包埋块的凸“点”底边应与玻璃刀刃平行;②安装玻璃刀,注意应与刀夹旁的标尺等高,调整刀的间隙角,一般为3°~5°;③调节刀与组织块的距离;④调节水槽液面高度与灯光位置;⑤调节加热电流及切片速度,接通电源,自动切片;⑥镜下选择银白色切片数片,将其捞到2~ 3张有支持膜的载网上,即每个载网上应载超薄切片数片。

(二)超薄切片染色

1.常用染色剂配制

(1)醋酸铀乙醇饱和溶液:将醋酸铀5g和50%乙醇50ml放入棕色滴瓶,摇动10min,使醋酸铀充分溶解。当最后仍留有部分未溶解的醋酸铀时,表明溶液已饱和,静置1~2d后取上清液使用。醋酸铀能与核酸、蛋白质等细胞内多数分子和结缔组织的纤维成分结合,也能与糖原、分泌颗粒、溶酶体结合,是目前使用最多的染色剂,但它对细胞膜着色较弱。另外,它有一定放射性及化学毒性,在光照和高温条件下不稳定,所以配好的溶液需放入棕色瓶,保存在4℃冰箱,备用。因长期放置该液体会产生杂质、污染切片、染色能力降低,故配制后不可储存过久。

(2)柠檬酸铅染液:将硝酸铅1.33g,柠檬酸钠1.76g和双蒸水30ml倒入50ml容量瓶,用力摇动1min,间隔摇动数次,约30min溶液呈乳白色,加入1mol/L的NaOH溶液8ml,溶液即变为无色透明。加双蒸水至50ml,摇匀,过滤后置冰箱密闭保存,备用。柠檬酸铅对细胞各种结构成分均有很强的亲和力,有全能染色液之称,尤其是可大大提高细胞膜性系统与脂类物质间的反差,亦能与细胞内核蛋白及糖原结合,并能穿透超薄切片的全层。缺点是极易与空气中的二氧化碳结合形成碳酸铅沉淀,污染切片,电镜下为黑色致密颗粒。因此,染色过程中要尽量避免其接触空气。同时,铅盐具有一定的毒性且能经皮肤吸收,配制和使用时应避免皮肤接触。

2.染色

(1)组织块染色法:指组织块经固定、脱水至70%丙酮后可用醋酸铀乙醇饱和液整块染色,时间2h以上或冰箱过夜。这样既可提高切片组织间反差,也可增强组织成分的稳定性,减少脱水造成的磷脂丢失。

(2)超薄切片染色法:增强切片反差的常规染色方法是醋酸铀-柠檬酸铅双重染色法。具体方法如下。①染色承载蜡盘制作:染色在蜡盘上进行,应制作两套带盖蜡盘,分别供醋酸铀染色与柠檬酸铅染色使用。在直径约15cm的玻璃平皿内铺加一层熔化石蜡,冷却后形成光滑平面,即染色承载蜡盘。近年常用塑料盖膜制成小盒代替蜡盘。②醋酸铀染色:染色前用洁净滴管吸取饱和醋酸铀染液滴到蜡盘上,量多少视切片数目定,把载网有切片的一面向下漂浮在染液滴上,再将皿底倒扣在蜡盘上,室温下染色15~30min。③清洗:用镊子将载网从醋酸铀染液中夹出,用双蒸水反复洗涤(用镊子夹住载网边缘,使载网与水面垂直,反复入水洗涤,每分钟50~60次,至少10min,双蒸水至少更换3次),滤纸吸去水分,自然晾干。④柠檬酸铅染色:取另一染色蜡盘,用洁净滴管吸取柠檬酸铅染液滴到蜡盘上(可事先在蜡盘中放几粒固体氢氧化钠,以吸附盘中的CO2,防止产生碳酸铅沉淀),将已染过醋酸铀的载网切片面向下漂浮在染液滴上,再将皿底倒扣在蜡盘上,室温染色15~30min。⑤清洗:用镊子将载网从柠檬酸铅染液中取出,用新双蒸水反复洗涤,洗涤方法同醋酸铀染色。