(一)样本制备和处理
流式细胞仪只能检测液体中悬浮的单个细胞,受检样本必须先制成单细胞悬液。以下介绍几种常用单细胞悬液的制备方法。
1.新鲜组织单细胞悬液制备 根据组织特性和实验目的,制备新鲜组织单细胞悬液可选用或联用以下3种方法,即酶消化法、机械法和化学法(EDTA螯合法)。
(1)酶消化法:①待检组织取得后即放入预冷的组织培养液或生理盐水洗去血液、污物,同时去除组织块中的纤维、脂肪、血管及坏死组织。②将清洗过修剪好的组织剪成1mm3小块放入预冷组织培养液漂洗,去除剪碎的细胞碎片。③取组织1.0g,加入酶消化液10ml,37℃水浴消化20~30min,期间每5min吹打振荡1次。④用预冷的培养液终止消化,收集细胞悬液,用200目筛网和350目尼龙网滤除凝集细胞团,收集、计数细胞,总数应不少于106个。⑤收集细胞悬液离心弃上清,将瓶底细胞吹打均匀后,加入预冷的70%乙醇(或0.5%~2%多聚甲醛)固定,并不断振荡以防防止细胞结团;固定的样本置于4℃冰箱中保存,备用,存放时间不可超过3周。
(2)机械法:这是利用剪碎、网搓或研磨等机械方法分离细胞的方法。此法对细胞损伤大,影响测试的精准度。具体方法有:①剪碎法:将修剪过的组织放入培养皿,加少量生理盐水(NS)或0.01mol/L、p H7.4的磷酸盐缓冲液(PBS),再将组织剪成匀浆。加入10ml NS或PBS,吹打后经200目筛网过滤,1500r/min离心3~5min,PBS离心漂洗3次,每次500~800r/min离心5~8min,收集细胞。350目尼龙网过滤,收集细胞并计数。②网搓法:将修剪过的组织置于套在烧杯口的尼龙网(100目)上揉搓,边搓边用PBS冲洗。将冲洗出的液体500~800r/min离心5~8min,收集细胞悬液,漂洗后收集细胞并计数。③研磨法:将修剪过的组织小块加1~2ml的PBS置于研磨器中研磨成匀浆,收集细胞悬液离心并计数。
(3)化学法:将修剪过的组织加0.2%EDTA液5ml,室温放置30min,捞出组织再加EDTA胰酶液5~10ml,37℃水浴消化30min,其间每5~10min吹打振荡1次。350目尼龙网过滤,离心收集细胞,计数,70%乙醇(或0.5%~2%多聚甲醛)固定,4℃冰箱保存,备用。
2.石蜡包埋组织单细胞悬液制备
(1)切成40~50μm厚石蜡包埋组织切片若干放入试管,二甲苯脱蜡1~2d,待无絮状物浮起,弃去二甲苯。
(2)梯度加入100%、95%、70%、50%乙醇各10min,蒸馏水3~5min水化。
(3)用0.5%胃蛋白酶消化液37℃水浴中消化30min,期间每5~10min振荡1次。
(4)终止消化,300目尼龙网过滤,离心收集细胞悬液。
(5)用制备好的细胞悬液涂片、染色、镜下观察细胞的完好程度。
(6)制备的单细胞悬液冷70%乙醇(或0.5%~2%多聚甲醛)固定,待检。
3.血液单细胞悬液制备
(1)肝素抗凝血1ml加Hanks液1ml稀释,缓慢加到淋巴细胞分离液表面,切勿与分离液混合。
(2)水平离心2000r/min、20min,液体出现分层,由上到下依次为血浆、单个核细胞(淋巴细胞、单核细胞、白血病细胞和网织红细胞等)、颗粒白细胞、红细胞。
(3)轻轻吸出单个核细胞层细胞,用Hanks液2000r/min、10min离心漂洗2次,收集细胞,计数,备用。
(4)如需进一步分离和纯化淋巴细胞或单核细胞,可用贴壁法、抗体补体工作法、磁力离心法再行分离。
(二)流式细胞仪操作
流式细胞仪调试、使用操作步骤如下。
1.打开电源,预热系统,稳定5min。
2.调节压力阀,使之达到适宜液流速度。
3.样品管内加蒸馏水冲洗液流喷嘴。
4.用校准标准样品调整仪器。
5.选定流速、测量细胞数、测量参数,并用同等条件检测对照样品。
6.检测完毕,用蒸馏水冲洗液流系统。
(三)常用检测举例
1.细胞表面抗原荧光检测
(1)直接免疫荧光染色法:①去除上清液,加冷PBA(PBA为等渗磷酸盐缓冲液加2%牛血清白蛋白,加0.1%叠氮钠)200μl,离心弃上清;②加入PBA稀释的荧光素标记单克隆抗体(稀释倍数由预实验确定)200μl,一组加正常IgG做对照,轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min,离心弃上清;③加冷PBS 200μl,离心洗涤2次,去除多余抗体;④加冷PBS 200μl,吹打混匀,液体移入测试管,4℃避光保存,待测。
(2)间接免疫荧光染色法:①去除上清液,加入冷PBA 200μl,离心弃上清;②加入用PBA适当稀释的小鼠抗人某种抗原的单克隆抗体200μl(第一抗体、稀释倍数由预实验确定),对照组加正常小鼠IgG,轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min,离心弃上清;③冷PBA离心洗涤1次,去除多余抗体,加用PBA适当稀释荧光素标记羊抗鼠IgG-FITC(第二抗体)200μl,吹打混匀,4℃或置冰浴中孵育30min(避光);④冷PBA离心洗涤2次,加冷PBS 200μl,吹打混匀,移入测试管,4℃避光保存,待测。
2.细胞凋亡检测
(1)亚“G1”峰检测法:①取70%乙醇固定2h以上的细胞(1~5)×106个,PBS离心洗涤1次;②将细胞悬浮于0.5ml PBS,加入DNA抽提缓冲液1ml,混匀,室温静置5min,离心,弃上清液;③将细胞悬浮于1ml DNA染液,室温下避光染色30min;④流式细胞仪测定:选用波长488nm激发光,同时测定红色荧光和前向角散射光,每例样品测定5000~10 000个细胞。
(2)末端转移酶标记法:①取已用1%多聚甲醛固定15min、80%乙醇固定2h的细胞(1~5)×106个,PBS离心洗涤2次;②离心去上清,每管加入反应液54μl(Td T酶18μl +反应缓冲液36μl),轻轻吹打后37℃孵育30min,期间每10min摇动1次;③加入终止液5ml和(或)洗涤液,孵育10min,离心去上清,重复此步骤1次后离心洗涤,加PBS 5ml制成悬浮细胞;④样品离心后弃上清,每管加入FITC反应液100μl(含亲合素-FITC,或链霉亲合素-FITC,或抗地高辛-FITC),室温避光孵育30min,离心去上清,加入PBS 5ml;⑤离心去上清,每管加入PI染液0.5~1ml(视细胞数目而定),吹打制成单个细胞悬液,室温下避光染色30min;⑥流式细胞分析检测:选用波长488nm激发光,检测绿色荧光(FITC,波长530±30nm)和红色荧光(PI,波长>620nm)。
3.淋巴细胞亚群检测 临床工作中最常需要分选的淋巴细胞亚群包括T细胞、B细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞5项有明确临床意义的淋巴细胞亚群。淋巴细胞亚群必须通过抗体联合进行检测,比较倡导的是联合CD45四色方案和联合CD45三色方案。CD45四色方案有两种组合的抗体选择:CD45/CD3/CD4/CD8四色标记(检测T 3、T 4、T 8三种亚群细胞)和CD45/CD3/CD19/CD16和(或)CD56做第二管标记(检测T3、B细胞、NK细胞)。CD45三色方案有四种不同试剂:①CD45/CD3/CD4(检测T3、T4细胞);②CD45/ CD3/CD8(检测T3、T8细胞);③CD45/CD3/CD19(检测T3、B细胞);④CD45/CD3/CD16和(或)CD56(检测T3、NK细胞)。
操作步骤:
(1)取100μl抗凝血加20μl荧光单克隆抗体,同时做阴性对照。
(2)振荡器混匀,暗室放置20min,加入500μl裂解液,振荡混匀,30℃水浴15min使细胞充分裂解至液体透亮。
(3)PBS离心洗涤2次,加入200μl的PBS吹打混匀,移入测量管。
(4)流式细胞仪检测,以阴性对照测出本底参数,调节荧光补偿,设定阳性参数值,计算出阳性表达细胞比例。
注意事项:
(1)检测前,用标准荧光球检测仪器变异系数。
(2)抗凝血标本在18℃环境下可保存2~3d,超过时间检测结果值可因细胞溶解偏低。
(3)冬天室温较低,细胞裂解剂作用所需要的时间较长,应适当延长裂解时间,以免红细胞裂解不充分使结果偏高。
(4)应同时做阴性对照、阳性对照、正常对照、质控对照,确保将试剂和操作过程对结果的不良影响降到最低。
(杨 鑫)
思考题
1.简述组织块原代培养的基本技术方法。
2.贴壁与悬浮细胞传代培养中应注意哪些问题?
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