一般操作流程

(一)组织基因组DNA提取

1.试剂

(1)TE缓冲液[p H8.0(10mmol/L Tris-Cl p H8.0+1mmol/L EDTA p H8.0)]

(2)DNA提取缓冲液(p H8.0,0.5%SDS TE缓冲液)

(3)蛋白酶K(20mg/ml)

(4)饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)

(5)乙酸铵(7.5mol/L)

(6)乙醇(100%和70%)

2.操作步骤

(1)新鲜组织切成小块,在预冷研钵中研碎;石蜡包埋组织按前面方法脱蜡、水化,用DNA提取缓冲液制成细胞悬液(100mg组织大约加1.2ml DNA提取缓冲液)。

(2)加入蛋白酶K(终浓度50μg/ml),温育50℃,2~3h。如果溶解效果不好,可延长温育时间或增加蛋白酶K浓度。

(3)用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提样品,1700g离心10min。(如果界面上有一层厚的白色物质,重复有机抽提)将上层(水溶液)转移至新管。

(4)加入0.5倍体积乙酸铵和2倍体积100%乙醇,1700g离心5min。

(5)小心弃上清,沉淀加70%乙醇离心洗涤1次,自然干燥。加适量水或TE缓冲液溶解。

(6)DNA浓度纯度测定及电泳DNA质量鉴定(按前面讲述方法)。

(二)外周血基因组DNA提取

1.试剂

(1)碘化钾(KI,5mol/L)

(2)生理盐水(0.9%NaCl)

(3)氯仿/异戊醇(24∶1)

2.操作步骤

(1)取200μl抗凝血,加入蒸馏水1ml,1700g离心5min。

(2)沉淀中加入KI 40μl,漩涡震荡0.5~1min。

(3)加入生理盐水200μl,氯仿/异戊醇300μl,震荡0.5~1min,1700g离心5min。

(4)~(6)同组织基因组DNA提取(4)~(6)。