基于技术的基因突变检测技术

(一)等位基因特异性寡核苷酸分析法

等位基因特异性寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide,ASO)分析法是一种以杂交为基础检测已知突变的技术。

1.基本原理 ASO是一段20bp左右核素或荧光素标记的寡核苷酸探针(包含发生突变的部位)。用其与固定在膜上的经PCR扩增的样品DNA杂交,由于完全互补DNA二聚体较有错配的DNA二聚体(杂交产物)稳定,通过与阳性、阴性样品对照,可判断出样品DNA基因型。

2.基本操作步骤

(1)以待检测样品DNA为模板,PCR扩增含有突变部位的目的基因片段。

(2)将PCR产物通过电泳胶(southern blot)或直接点滴(dot blot)转到膜上。

(3)DNA变性(如将膜浸入0.1M NaOH溶液)。

(4)ASO与膜上DNA杂交(可通过中和NaOH的方法,完全互补的DNA-ASO二聚体稳定存在,而有错配的二聚体溶解)。

(5)显色(根据ASO上标记的发光物质选择合适的显色方式,如X线胶片曝光显影)。

(6)结果判断(根据设置的阳性、阴性对照判断样品基因型)。

(7)更换ASO,重复杂交(可通过沸水洗掉膜上已检测探针,加入新探针重复杂交过程)。

(二)单链构象多态性和异源双链分析法

单链构象多态性(single-strand comformational polymorphism,SSCP)和异源双链分析法(heteroduplex analysis,HA)是利用电泳检测未知突变的技术。

1.基本原理 单一碱基变化也能够改变DNA单链构象,从而造成电泳迁移率的改变(SSCP);在DNA双链中,单一碱基变化导致局部错配发生,DNA双链构象发生改变,从而造成同源双链和异源双链间电泳迁移率的差异(HA法)。根据电泳迁移率的变化可判断被检测DNA片段中是否存在基因突变。

2.基本操作步骤

(1)以待检测样品DNA为模板,PCR扩增可能含有突变的目的基因片段。

(2)变性:将PCR产物98°C变性10min,立即冰浴骤冷,使其成为单链(SSCP)或于68°C复性为同源/异源双链(HA法)。

(3)电泳:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(4)染色:如在PCR扩增中用核素或荧光素等标记引物或核苷,可用X线胶片曝光显影,也可在电泳后用银或溴化乙锭染色显示结果,再根据泳动速率变化,判断突变有无。

3.检测注意事项 用PCR-SSCP法检测片段小于200bp的PCR产物时,突变检出率可达70%~95%,而片段大于400bp时,检出率仅为50%左右;该法可能会存在1%的假阳性率。HA法分离也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用,两者结合使用,可使突变检出率提高到接近100%。