为基础的基因突变检测技术

Real-time PCR以PCR反应体系中的荧光染料为指示剂,从而实现了目的基因扩增与数据收集、分析同时进行并实时监测。理论上,在PCR扩增指数增长期,同一荧光强度下, PCR扩增的循环数(Cq值)与初始模板量呈对数呈线性关系,从而能够实现对初始模板量的定量分析,这一方法已广泛用于基因表达差异、基因拷贝数改变等的定量分析。

能够实现real-time PCR实时检测的化学发光方法主要有两类:探针法和染料法。依据发光原理,探针主要分为两类:水解型探针(hydrolysis probe)和杂交型探针(hybridization probe)。水解型探针(如Taqman探针)两端分别标记荧光基团(5′端)和淬灭基团(3′端),探针完整时,荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收,没有荧光产生。PCR扩增时,探针与模板特异性结合,DNA聚合酶的5′-3′外切酶活性将探针水解,荧光基团切掉,远离淬灭基团,因此荧光能够产生。杂交型探针一般由2条探针组成,一条5′端标记供体基团,3′端封闭(阻止继续延伸),另一条3′端标记受体基团。自然状态下,只能检测到供体基团发出的荧光,当2条探针都与目的基因片段特异性结合时,供体基团与受体基团相互靠近,通过荧光共振能量转移,供体基团激发受体基团发出荧光,此时能够检测到受体基团发出的荧光。染料法是应用与双链DNA结合的染料(如SYBR Green,Eva Green),在DNA扩增时与双链DNA非特异性结合,从而收集荧光信号。

根据已知基因突变位点设计特异探针,衍生出了以real-time PCR为基础的基因分型技术,代表性的有Taqman探针法和ARMS法。用饱和DNA双链荧光染料(如LCGreen)代替定量分析常用的不饱和荧光染料,又衍生出能够实现对未知突变扫描的高分辨熔解曲线(High resolution melting)分析法等技术。它们都是目前应用较广的基因突变检测技术。

(一)Taqman探针法

Taqman探针法是通过特定基因型探针与相应靶基因完全互补结合,以荧光指示区分不同基因型,检测已知基因突变的方法。

1.基本原理 依据要检测的已知基因突变位点设计相应的一对探针,一条与突变型基因互补,一条与野生型基因互补。两条探针5′端分别标记不同的荧光基团。在PCR扩增过程中,退火时探针同与其互补的模板DNA结合,延伸时,由DNA聚合酶(具有5′-3′外切酶活性)将探针水解,释放荧光,real-time PCR仪收集荧光信号。检测结束时,依据两种荧光信号(分别由两条探针标记的)的比例,判断样品DNA的基因型。

2.基本操作步骤

(1)设计含有待检测基因突变位点的引物和Taqman探针(通常PCR产物长度小于400bp,Taqman探针15~30bp,2条探针分别标记不同荧光基团,常用Fam和Hex。近年来推出的3′端标记非荧光淬灭分子Taqman-MGB探针能够有效降低本底荧光信号强度)。

(2)PCR扩增,荧光信号收集(选用具有5′-3′外切酶活性的Taq酶)。

(3)数据分析,结果判断(与突变型互补的探针荧光信号为主,提示样品DNA为纯和突变型;与野生型互补的荧光信号为主,提示样品为野生型;两种荧光信号都有,提示样品为杂合突变型。)

3.仪器选择 具有探针标记荧光素激发光与发射光波长通道的real-time PCR仪均可以用于本方法检测。

(二)ARMS法

ARMS(amplification refractory mutation system)法,即扩增阻滞突变系统技术,又称等位基因特异性扩增法(allele-specific amplification,ASA),是通过特异性引物选择性扩增特定基因型的基因片段,并用电泳或real-time PCR法判定相应基因型,从而检测特定已知基因突变有无的方法。

1.基本原理 针对含有待检测突变位点设计两对引物扩增同一段目的基因,其中下游引物相同,上游引物有两条(突变位点位于上游引物3′端),一条与野生型基因完全互补,另一条与突变型完全互补。PCR扩增时,只能扩增与引物完全互补基因型的基因片段。在突变型引物加入荧光标记(如蝎形探针),如果待检测样品含有相应基因突变,就能检测到荧光信号,如样品没有突变,则检测不到荧光信号。

2.基本操作步骤

(1)特异性引物设计:特异性引物包括2条分别与突变型、野生型基因完全互补的上游引物和1条共同的下游引物。突变型引物与野生型引物仅有1个碱基(突变位点)的差异,对于野生型基因,突变型引物会引起3′端的错配而抑制PCR延伸反应。然而,有的错配(如GG错配)较弱,野生型目的基因也可能以突变型引物扩增出来。因此设计引物时常要在突变邻近位点增加1个错配碱基,防止野生型目的基因的错误延伸,从而增加检测特异性。

(2)PCR扩增:在PCR扩增时应注意不断优化、调整实验条件,如筛选Taq酶浓度,为减少非特异性扩增加入甲酰胺等。

(3)电泳或real-time PCR法检测基因型:由于real-time PCR法检测基因型时,PCR反应产物不需要取出避免了二次污染的可能,PCR反应与检测的同时进行又提高了检测效率,缩短实验时间,故目前应用的较电泳法更为广泛。

3.仪器选择 real-time PCR仪检测通道与荧光标记激发光与发射光波长匹配的均可用于本检测方法。

(三)高分辨熔解曲线(High resolution melting)分析法

高分辨熔解曲线分析法以饱和DNA双链荧光染料为指示剂记录升温过程中目的基因片段熔解的曲线,通过比较待测样品与野生型基因(阴性对照)的熔解曲线差异,对目的基因片段中突变有无进行扫描,以达到检测未知突变的目的。

1.基本原理 随着温度的升高DNA双链会逐渐解链(熔解),与双链嵌合的饱和荧光染料分子随之解离,荧光强度减弱。随温度增加荧光强度下降的曲线称为DNA熔解曲线,它能代表目的基因片段双链解开的全过程。目的基因片段中的任何单一碱基变化都会影响溶解过程,进而改变熔解曲线形状。因此,可以通过与野生型基因片段熔解曲线形状比对,判断目的基因片段中是否存在突变。

2.基本操作步骤

(1)引物设计:一般使用的是普通PCR引物,不需要特殊标记和修饰,缩短目的基因片段长度可以提高突变检测的灵敏度,通常目的基因片段小于200bp较好。

(2)PCR扩增(扩增体系中含有饱和荧光染料)。应注意优化PCR反应条件和避免非特异性产物扩增。这是是能否准确判断检测结果的关键。

(3)熔解曲线信号收集、结果分析。比对样品与野生型基因样品的溶解曲线形状,如有差异则可判定扩增样品DNA片段中存在突变。杂合性突变,熔解曲线形状改变较大,容易与野生基因型区分;纯和性突变,熔解曲线形状变化较小,主要表现为熔解曲线在温度轴(横轴)上的平移,应该特别注意。

3.仪器选择 检测需要使用配有高分辨熔解曲线通道的real-time PCR仪或高分辨熔解曲线分析仪(如LightScanner®96等)。