序列测定技术

目前认为DNA序列测定(DNA sequencing)技术是基因变异检测的“金标准”。应用各种突变检测技术检测到的基因突变,最后都要用序列分析确定突变类型及突变位置。自1977年Sanger建立双脱氧终止法(dideoxy chain termination)测定DNA序列,Maxam和Gilbert建立以化学修饰法为基础的DNA序列分析以来,DNA测序技术向快速、高通量、低成本的方向不断改进,目前已经发展到了第三代。

(一)第一代测序技术

以Sanger建立的双脱氧终止法为代表的DNA测序技术被称为第一代测序技术。

1.基本原理 以单链或双链DNA为模板,以DNA引物、DNA聚合酶(常用T7 DNA聚合酶)、按一定比例参入了2′,3′-双脱氧核苷三磷酸(2′,3′-deoxynucleoside triphosphate,dd NTP)的2′-脱氧核苷三磷酸(d NTP)为底物,催化合成与待测DNA模板序列互补的新链。当dd NTP加入到互补链末端,能够阻止互补链的延伸,从而会产生以dd NTP结尾的不同长度DNA片段混合物。通过电泳分离就可获得一系列3′末端为dd NTP的DNA片段电泳条带,根据荧光标记(或放射自显影)直接读出DNA的核苷酸顺序。

2.测序基本流程

(1)测序载体和引物:将待测DNA片段克隆到M13载体或质粒载体,以合成的寡核苷酸片段为通用引物。不需要对全部DNA片段(通常为纯化后的PCR产物)测序时也可不用DNA片段克隆,选一端引物作为测序引物。

(2)酶促引物合成反应生成与待测DNA片段互补的DNA新链。

(3)测序:电泳分离,读出序列。

3.代表性测序技术平台 ABI3100,ABI3730等。

(二)第二代测序技术

在Sanger测序法基础上开发的以高通量、快速和低成本为特征的一组测序技术平台。

1.基本原理 虽然各种测序技术平台的基本原理有所不同,但都通过将待测DNA片段打断形成长度接近的多条片段,然后以同时测序的方式实现高通量检测。尽管每种测序技术平台的信号读取方式并不相同(如454通过合成时释放的焦磷酸作为检测信号,Solexa检测合成时释放的荧光信号,SOLiD连接酶连接后释放荧光信号),但都是通过在合成反应同时读取数据来提高测序速度。

2.测序基本流程

(1)构建待测DNA文库,将待测DNA片段打断为小片段,连接载体。

(2)测序模板准备,通过emulsion PCR或bridge PCR扩增文库中小DNA片段。

(3)测序,读取序列。

3.代表性测序技术平台 454 sequencing,Solexa technology,SOLiD platform等。

(三)第三代测序技术

实现单分子测序,测序前不需要PCR反应,从而避免PCR过程造成的错误是第三代测序技术的主要特征。代表性测序技术平台有Heliscope,Nanopore,Single-molecule realtime(SMRT)等。