生物样品预处理新技术

2.2.3.1　液－液萃取新技术

传统的液－液萃取技术存在消耗大量有机溶剂、操作复杂、两相分离不完全、易发生乳化、不适于提取强极性或多电荷药物、难以实现自动化等缺点。近年来，各种新型的液－液提取技术不断出现，克服了一些传统液－液萃取技术的缺点，使液－液萃取技术在体内药物分析中的应用不断增加。下面简单介绍几种液－液萃取新技术。

1.Extrelut NT液－液萃取

传统液－液萃取过程中一般需通过剧烈振摇使互不相溶的两相充分接触来提高萃取率，但此操作易产生乳化现象。为了减少乳化现象，20世纪80年代出现了一种在多孔性硅藻土上进行的液－液萃取(Extrelut NT液－液萃取)。Extrelut NT是一种经过特殊处理的萃取用硅藻土填料，该填料具有很大的孔体积，且化学惰性，能吸附水相溶液。水溶液样品上样到Extrelut NT柱上后，水相溶液(含待测组分)以一层薄薄的液膜分布在大孔硅藻土填料表面。随后，利用和水不互溶的有机溶剂如乙醚、乙酸乙酯或三氯甲烷等进行洗脱。所有的脂溶性待测成分从水溶液中提取出来进入有机相，而水相则保留在填料表面。流出的洗脱液仅为有机溶剂，可以直接或蒸干后用于下一步的分析。萃取过程如图2－7所示。

图2－7　Extrelut NT液－液萃取过程

该方法利用硅藻土的大表面积分散水相溶液，使有机相不经过剧烈振摇即能与水相充分接触，从而有效地消除乳化和两相分离不完全的现象。硅藻土具有优异的化学稳定性和良好的物理性能，pH应用范围广(pH1～13)，通过改变水相的pH可分离不同性质的样品。在理想条件下，酸性、中性、碱性的样品都可以用这种原理分离。除此之外，该法还具有前处理简单(硅藻土不需活化)、重现性良好、溶剂用量少、可同时处理多个样品等特点，是一种快速经济的液－液萃取方法。现已有商品化的Extrelut NT液－液萃取装置(如图2－8)。

图2－8　Extrelut NT液－液萃取装置

2.均相液－液萃取

均相液－液萃取法(homogeneous liquidliquid extraction，HLLE)是一种利用相转变分离现象使原本呈均相的混合溶液(通常由水和与水相混溶的有机溶剂组成)分层，并同时将待测成分提取至有机溶剂层的新型液－液提取法。在均相混合溶液中，水相与有机相之间没有界面，接触面积无限大，不需经过剧烈的物理振荡即可获得高的提取率，且重复性良好。特别适合于亲水性强的药物的液－液提取。

HLLE根据分层原理的不同可分为:盐析辅助均相液－液萃取(salting－out homogeneous liquid－liquid extraction，SHLLE)、分散液－液微萃取法(dispersive liquid－liquid microextraction，DLLME)和零下低温液－液萃取(subzero－temperature liquid－liquid extraction，STLLE)。其中SHLLE为最重要的HLLE法之一，在体内药物分析中日益受到重视。其原理是加入足够量的无机盐试剂后，均相混合溶液中两相的互溶能力降低而出现分离。盐析试剂的选择是SHLLE法的重要条件，选择原则是:①所选盐析试剂必须难溶于与水相混溶的有机溶剂(提取溶剂);例如卤化锂可溶于丙酮，加入卤化锂后，丙酮－水的均相溶液不会分层。②所选盐析试剂在水中的溶解度应尽可能大，以使盐析作用最大化。不同盐的盐析作用大小顺序为:MgCl2≈MgSO4＞(NH4)2 SO4≈NaCl＞Na2 SO4≈KCl＞NH4 Cl＞K2 SO4。③盐的浓度与均相混合溶液的分离程度密切相关，低浓度的盐只能起到沉淀蛋白的作用，只有高浓度的盐(一般应≥1mol·L－1)才可以使均相混合溶液分层。高浓度的盐对后续的分析方法有一定的影响，如可能会引入对质谱仪有害的盐和水分。用质谱友好型易挥发盐(如乙酸铵和甲酸铵)代替难挥发无机盐(氯化钠、氯化镁等)可改善这个问题。与水相混溶的极性有机溶剂均可作为SHLLE的提取溶剂，如乙腈、异丙醇、甲醇、乙醇、丙酮和二甲亚砜等。其中乙腈为最常用的提取有机溶剂。

与传统的LLE不同，HLLE可选用与后续分析系统相适应的提取溶剂(如乙腈、甲醇)，只要灵敏度符合要求，就可以省去溶剂吹干的步骤，简化前处理步骤，提高前处理效率，使高通量分析成为可能。

3.液－液微萃取

液－液微萃取(liquid－liquid microextraction，LLME)是液－液萃取的小型化技术，目的是大量减少有机溶剂的用量并简化操作步骤。该法的设计理念是将有机相制成微滴，增大与水相的接触面积，快速达到萃取平衡并提高萃取效率。形成微滴的有机溶剂用量一般为几到几十微升，且可直接进样分析。现有的液－液微萃取方法包括单滴微萃取(single－drop microextraction，SDME)，中空纤维液体固相微萃取(hollow fiber liquid phase microextraction，HF－LPME)和分散液－液固相微萃取(dispersive liquid－liquid microextraction，DLLME)。SDME可以进一步分为直接浸入单滴微萃取(direct immersion single－drop microextraction，DI－SDME)、顶空单滴微萃取(headspace single－drop microextraction，HS－SDME)、液－液－液微萃取(liquid–liquid–liquid microextraction，LLLME)等静态萃取技术和连续流微萃取(continuous－flow microextraction，CFME)等动态萃取技术。各方法的萃取原理见图2－9。其中HF－LPME在体内药物分析中的应用较广泛。HF－LPME属于一种膜液相技术，能富集100倍以上的待测成分，适用于各种极性的有机或无机化合物，溶剂消耗量少，样品净化效率高，且易于自动化。DLLME的主要优点是操作简单，快速，成本低，回收率高，环境污染小。然而，这种技术中使用的提取溶剂种类有限，限制了该技术的应用。

图2－9　各种液－液微萃取技术的原理示意图