化学键合相色谱

虽然液－液分配色谱具有较高的分离效能和温和的色谱条件，但载体表面涂渍的固定液易流失，不适用于梯度洗脱操作，成为阻碍该种方法发展的重要因素，针对这一问题，人们将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶(载体)表面的游离羟基上，生成化学键合固定相，进而发展成键合相色谱法(bonded phase chromatography，BPC)。该种色谱方法具有均一性及热稳定性好、色谱柱柱效高、重现性好、使用寿命长、流动相和键合相的种类多、分离选择性高、适合梯度洗脱等优势。因此，化学键合相色谱已经逐渐取代液－液分配色谱，获得日益广泛的应用，在高效液相色谱法中占有极为重要的地位。

与液－液分配色谱法相似，根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，化学键合相色谱又可分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。

4.1.3.1　正相键合相色谱

在正相键合相色谱法中使用极性键合固定相。该种固定相将全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体经过酸化处理制成表面含有大量硅醇基的载体后，再将含有腈基(－CN)、胺基(－NH2)、醚基(－O－)的硅烷化试剂反应生成表面具有腈基、胺基、醚基等的极性固定相。流动相则选用非极性或弱极性的溶剂。

正相键合相色谱法的分离选择性决定于键合相的种类、流动相的强度、样品组分性质等多种因素，通常情况下样品中强极性组分容量因子k大，保留时间tR长，后洗脱出峰。当流动相极性增强时，洗脱能力增加，样品组分k减小，tR减小。

4.1.3.2　反相键合相色谱

反相键合相色谱又称为非极性键合相色谱，键合固定相的极性小于流动相的极性，适于分离非极性、极性或离子型化合物，其应用范围比正相键合相色谱法更广泛，是高效液相色谱法最主要的分析手段。

反相键合相色谱法中键合相的表面采用弱极性的烃基，如十八烷基(C18)、辛烷基(C8)、甲基、苯基等。短链烷基键合相适用于极性化合物的分离，苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多烃基化合物(如黄酮苷类)等。而最常用的是十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)，它是由十八烷基硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基经多步反应生成的键合相，对各种类型的化合物具有良好的适应性，且具有载样量大、稳定性好、不易流失、适于梯度洗脱等优点，但在实际应用中需注意流动相的pH范围，一般要求pH为2～8，否则会引起硅胶溶解。

反相键合相色谱法中的流动相常以水作为基础溶剂再加入一定量与水混溶的极性调整剂，如甲醇—水、乙腈—水等。通常情况下，甲醇—水作为流动相可以满足多数样品的分离需求，并具有黏度小、价格低等优点。而乙腈的极性更低，溶剂强度较高，黏度较小，其截止波长(190 nm)比甲醇(205 nm)短，更适用于利用化合物末端吸收进行检测。此外，在反相键合相色谱法中经常选择弱酸(如醋酸)、弱碱(如氨水)及缓冲盐(如磷酸盐、醋酸盐等)作为抑制剂，调节流动相的pH，抑制样品组分解离，增强保留。调节流动相的离子强度还有助于改善分离效果，减少峰的拖尾。在反相键合相色谱中洗脱次序与正相色谱相反，即极性大的化合物先洗脱(k小，tR亦小)，而极性小的化合物不易洗脱(k大，tR亦大)。