同位素示踪相关技术

同位素(isotope)是具有相同原子序数但质量数不同的核素，如，，。它分为放射性同位素(radioactive isotope)和稳定性同位素(stability isotope)。同位素示踪又称示踪技术、示踪原子法、同位素标记等，是利用放射性示踪原子或化合物，研究被追踪物质运动、转化规律的方法。由于标记化合物与其相应的非标记化合物(被追踪物质)具有相同的化学和生物学特性，在生物机体内所发生的化学变化和生物过程也完全相同，将两者混合后，用化学方法不能分离，只能通过放射性比度的变化(放射性同位素示踪)或同位素比值的变化(稳定同位素示踪)测出同种的非标记化合物的含量，从而反映被追踪物质在有机体内的生物利用率及代谢规律。

8.2.2.1　放射性同位素示踪技术

放射性同位素示踪技术是利用放射性核素及其标记物作为示踪剂来研究生物体内各种物质的吸收(Absorbtion)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)及排泄(Excretion)即ADME规律的一门科学。同位素示踪所利用的放射性核素(或稳定性核素)及它们的化合物，与自然界存在的相应普通元素及其化合物之间的化学性质和生物学性质是相同的，只是具有不同的核物理性质。因此，就可以用同位素作为一种标记，制成含有同位素的标记化合物(如标记食物，药物和代谢物质等)代替相应的非标记化合物。利用放射性同位素不断地放出特征射线的核物理性质，就可以用核探测器随时追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变等。其检测方法主要有液闪技术、放射自显影技术和小型正电子发射断层扫描技术。

放射性同位素和稳定同位素都可作为示踪剂，但是，与稳定同位素相比，放射性同位素示踪技术应用更为广泛，因为具有如下特点:①灵敏度高:放射性示踪法可测到10－14～10－18 g水平，即可以从1015个非放射性原子中检出一个放射性原子。它比目前较敏感的重量分析天平要敏感108～107倍，而迄今最准确的化学分析法很难测定到10－12 g水平。②方法简便:放射性测定不受其他非放射性物质的干扰，可以省略许多复杂的物质分离步骤，体内示踪时，可以利用某些放射性同位素释放出穿透力强的γ射线，在体外测量而获得结果，这就大大简化了实验过程，实现非破坏性分析。随着液体闪烁计数的发展，14 C和3 H等发射软β射线的放射性同位素在医学及生物学实验中得到越来越广泛的应用。③定位定量准确:放射性同位素示踪法能准确定量地测定代谢物质的转移和转变，与某些形态学技术相结合(如病理组织切片技术，电子显微镜技术等)，可以确定放射性示踪剂在组织器官中的定量分布，并且对组织器官的定位准确度可达细胞水平、亚细胞水平乃至分子水平。④符合生理条件:在放射性同位素实验中，所引用的放射性标记化合物的化学量是极微量的，它对体内原有的相应物质的重量改变是微不足道的，体内生理过程仍保持正常的平衡状态，获得的分析结果符合生理条件，更能反映客观存在的事物本质。但射线对生物体的作用达到一定剂量时，会改变机体的生理状态，这就是放射性同位素的辐射效应，因此放射性同位素的用量应小于安全剂量，严格控制在生物机体所能允许的范围之内，以免实验对象受辐射损伤。

如表8－2所示，那些低能量β射线发射体是用于药物ADME研究的重要放射性同位素。粒子发射能、半衰期和比放射性是用于评选的3个重要特性。其中半衰期即是放射性元素的原子核有半数发生衰变时所需要的时间。同位素的比放射性是每毫克原子的放射性活度。放射性活度的单位是居里(Ci)，也即相当于每分钟2.22×1012次衰变。已经被规定为国际标准单位的贝克勒尔(Bq)相当于每秒一次衰变(1Ci=3.7×1010 Bq)。低能量的14 C和3 H是药物ADME研究中最常用的两种放射性核素。这两种核素的半衰期分别为5730年和12.35年，由于其半衰期长，在实验周期中测得的数据一般不需要进行物理半衰期的矫正，以便于测量及结果的计算。3 H是一种较弱的β发射体，因而比14 C更难探测和测量。但3 H足够长的半衰期带来的较高的比放射性以及3H标记物合成的简便性，使得3 H标记物在能够满足实验的情况下，也常被选作示踪剂。应用于药物ADME研究的常见的同位素特性见表8－2所示。

表8－2　应用于药物ADME研究的同位素

如今随着小型正电子发射断层扫描(positron emission tomography，PET)仪器的发展，利用11 C、13 N、15O、18 F等放射性核素进行ADME研究的实例也日渐增多。在放射性示踪剂的选择上，应根据实验目的、实验周期以及操作者安全等几方面综合考虑，包括所选放射性同位素的射线类型、半衰期、放射化学纯度、比活度、毒性及标记位置等。常用的放射性示踪剂多为单一放射性同位素标记的化合物，有时为了实验的特殊需要，也可以采用双标记或多标记的放射性物质，但此时使用的标记原子最好不同能量或发射不同类型射线的核素。常用的有14 C/3 H、14 C/125 I、125 I/131 I等。

在放射性示踪实验中，示踪原子及其标记位点的选择是十分重要的。除需考虑实验目的、分析检测方法外，还应特别考虑示踪原子在标记化合物中的稳定性，避免标记原子中途脱落而失去示踪作用。因此，在选择标记位点时应该首先考虑示踪原子在分子结构中的稳定性。

选择标记位点时，研究者可利用计算机辅助代谢物预测技术(computer assistedmetabolism prediction，CAMP)预测化合物分子结构中的稳定部位。一般来说，应首先考虑对分子结构中的芳香环或酯环上的C原子进行标记，而尽可能避免在羧基、羟基、氨基、亚氨基等活性部位进行标记。因此一旦这些不稳定基团脱离母体化合物，就失去了对母体药物及主要代谢物的示踪的能力。而且，标记位点还应远离化学键断裂位置，以避免同位素效应的影响。如果母体化合物在代谢过程中因化学键断裂同时生成2个主要代谢产物，在母体化合物标记时可考虑采取双标记技术。

放射性同位素示踪技术为揭示药物在体内外的药物ADME各个过程，阐明生命活动的物质基础起了极其重要的作用。主要应用于药物在体内外物料平衡、组织分布、排泄途径，阐明药物在体内的生物转化机理，以及从动物实验数据推断相应的人类实验结果等。在美国等国家，在多于90%的新药开发过程中，Ⅰ期临床试验中的安全性评价都需要放射性同位素实验数据的支持与证明。而在国内，由于伦理等各种因素的限制，目前还几乎没有将同位素示踪法应用于人体进行各项药代动力学研究的实验。

8.2.2.2　稳定同位素示踪技术

自然界中存在着碳、氢、氧、氮等有机化合物中常见元素的稳定同位素，丰度最高的稳定同位素是2 H、13 C、15 N、18 O等。研究者采用哪一种特殊的同位素将根据研究性质和目的决定。常见稳定性同位素的丰度见表8－3。

表8－3　稳定同位素的丰度

稳定同位素存在于自然界而无辐射污染，故可安全地用于人体。常用的检测分析技术有核磁共振(NMR)分析技术、气相色谱与质谱联用(GC/MS)、液相色谱与质谱联用(LC/MS)等。稳定同位素示踪作为一项有力的研究工具，可阐明体内代谢物质(如糖、脂、氨基酸、蛋白质等)的整体、动态代谢情况。

在任何涉及使用稳定同位素的计划中，首先选择一种合适的标记化合物并考虑它的来源。小批量的化学合成，通常工作量很大，因而同位素本身往往占总价格的很少部分。我们应该要注意到，在合成步骤的序列中，同位素的引入要越晚越好。高产率是重要的，并应严格考虑回收未使用的同位素的可能性。在分子的特定位置进行标记，要考虑到所用检测方法的灵敏度以及在研究体系中可能发生的同位素稀释。应当强调，既然稳定同位素是天然存在的，那么分析测量就涉及某品种的天然丰度和被测化合物中的丰度。当遇到严重的稀释时(如在人体临床研究中经常会遇到)，可以用尽可能高的富集度，致使这种差值成为最大。

稳定同位素示踪技术是利用人工富集或贫化的稳定同位素代替天然同位素，在不改变化学性质和生理特性的前提下，使物质打上同位素的“印记”。通过质谱法、密度法、热导法、光谱法、四级杆电感耦合等离子体质谱(ICP－MS)等仪器测定其同位素比值的变化，可显示物质的行踪和产物。

目前稳定同位素的应用虽然不如放射性同位素使用广泛，但稳定同位素在应用中明显优于放射性同位素，具有无可比拟的优越性，原因是:①无辐射，营养元素的稳定同位素对动植物体并不造成伤害，就算是有毒重金属元素，危害性也远小于放射性同位素;②许多元素没有放射性同位素，还有一些元素虽然有放射性同位素，但半衰期太短而没有实用性;③不像放射性同位素一次只能测定一种同位素，稳定同位素允许对不同质量数进行同时测定，因此可以对同一元素的同位素进行测定;④物理性质稳定，信号值不会随时间而衰减;⑤弥补了放射性同位素在种类上的不足，例如对于营养学研究中最关注的机体内一些重要元素的示踪，如氮、碳、氧、氢等均没有合适的放射性同位素，它们的放射性同位素的半衰期不是太长就是太短;⑥在利用质谱仪、核磁共振谱仪等仪器作为稳定同位素标记化合物的测定手段时，不仅可以测定同位素的丰度，还可以同时测定示踪物的结构，对示踪原子进行定位，从而进行代谢研究;⑦可以更方便地进行多标记实验;⑧允许短期内多次重复实验。

随着同位素技术的日益成熟和相应检测技术的不断发展，稳定同位素示踪技术的应用领域不断拓展。目前人们对营养元素对人体的影响高度关注，使得各种有益元素的代谢研究成为热点，而稳定同位素技术的优点将为此研究提供有效的技术支持。此外，近年来重金属污染和中毒事件频发，重金属对环境和人体的潜在危害越来越受到人们的普遍关注，研究其在生物体内的迁移转化规律和存在形态是阐明其毒理学和其他生物效应的重要依据。稳定同位素示踪技术因其方法安全、准确并且相对简单，因此在这一领域的应用将越来越广泛。