质谱成像的原理和方法

8.3.2.1　IM S的技术原理

IMS的过程包4个基本步骤:样本制备、离子化技术的选择、分子的质量分析和图像重构。即将组织样本在低温条件下切片后转移至具有导电性的靶上，喷涂基质并干燥，通过离子束或激光照射，使组织切片表面的分子解吸并离子化，然后由质谱的质量分析器测定这些离子化分子的m/z值，利用软件将测得的质谱信息转化为像素点，最终重构出组织表面上的分子分布图像。

IMS有Microprobe和Microscope两种空间信息获取模式。Microprobe模式较为常用，在该模式下，离子束或激光逐点照射组织表面，可检测到每个点上分子的m/z信息并单独储存。Microscope模式则是以非聚焦的激光或离子束扫描组织切片表面，将所得分子的m/z值、强度及其在组织上的位置信息一起储存在该模式下可获得较高的空间分辨率，但它只能与特定的质量分析器联用。根据激光或离子束在组织上取点数量的不同，可将IMS分为profiling和imaging两种方式。Profiling方式的特点是在组织表面取5～20个不连续的点(直径约为1 mm)，该方式的空间分辨率较低，通常用于比较两种组织的异同;Imaging方式则是在整个组织切片上按照特定的规则选取数千个点(直径为30～150μm)进行连续分析，然后将测得的信息进行图像重构，从而获得分子在组织中分布的谱图，其空间分辨率较高。

8.3.2.2　样品制备

IMS的样本制备极其重要，将直接关系到研究结果的准确性和重复性。样本制备主要包括样本的收集和储存、组织切片、组织预处理、基质选择和基质喷涂等方面。以基质辅助激光解析电离(Matrix–Assisted Laser Desorption Ionization–IMS，MALDI－IMS)为例介绍IMS样本制备过程如下:获得新鲜的组织样本后，为避免组织中杂质的干扰和目标分子的降解或移位，需要将组织中的残留血液细心清除并迅速储存于低温环境。通常用液氮预冷后，再存储于低于－80℃的温度下，可以选择使用乙醇或异丙醇预冷，也可用福尔马林或石蜡包埋法储存样本。

组织切片时的环境温度、切片厚度及其转移方式，是影响实验重复性和分子相对位置的关键因素。样本一般使用冰冻切片机切片，操作温度根据组织类型控制在－25℃～5℃的范围内，切片厚度一般为3～20μm，可保证质谱分析时足够的组分浓度。切片完成后，需要将样本转移至MALDI靶板，转移方法有两种，可以将切片通过导电双面胶，也可以室温下，直接将冰冻组织切片粘到靶上。切片转移后需立即真空干燥30min，并采用适当的有机溶剂，如乙醇或异丙醇，洗涤组织切片，除去盐的干扰。此外，组织染色可以帮助纠正成像结果，方法有IMS前染色和IMS后染色，IMS前染色需选用与质谱检测兼容的染料，如甲酚紫和亚甲基蓝，而苏木精－伊红染色会影响质谱结果，通常在IMS检测后使用。

在MALDI离子化方式下，IMS的基质种类和覆盖方法十分重要。基质溶液的组成通常包括3部分:有机溶剂(如甲醇或乙腈)、基质和三氟乙酸。基质的选择主要依据被分析物的物理化学特性。常用的基质化合物有3，5－二乙氧基－4－羟基肉桂酸(又称芥子酸，SA)、α－氰基－4－羟基肉桂酸(CHCA)和2，5－二羟基苯甲酸(DHB)。其中，溶于50%～60%乙腈SA溶液适用于高分子量的蛋白(大于5000Da)，对多肽分析通常采用CHCA或DHB的50%乙腈溶液;DHB的60%～70%乙醇溶液适用于脂类化合物分子的分析研究。

在目前的质谱成像技术中，基质覆盖方法主要有两类:点样法和喷雾法。点样法是用手工操作的方法将基质溶液直接点于样品表面，操作方便，但是容易产生相对比较大的样品点(直径为1～2 mm)和方法重现性较差，目前多采用自动化的超声点样法(acoustic deposition)和打印点样法(inkjet printing)。这两种点样方法都可以让每个基质样品点排列紧密而且相互松散，并且样品点的直径比较小(80～200μm)。而喷雾法则是将基质溶液均匀地喷在组织切片的表面，这样得到基质样品点与基质的本身形成的晶体大小相关，一般直径为1～20 μm。其质谱成像后的图像分辨率更多地取决于所采用的激光在样品表面上产生的光斑大小以及在组织切片表面扫描时采取的步长(raster)大小。喷雾法能产生比点样法更高质量的图像，具有更广泛的应用前景。其他的基质点覆技术还有大液滴滴加法(large droplet)、电喷雾喷涂法(electrospray deposition)以及浸润法(immersing)等，根据实际的需要采取不同的基质覆盖方法有利于得到需要的分析结果。

8.3.2.3　离子化技术

IMS离子化方式的选择与IMS的空间分辨率和信号强弱密切相关。目前主要有3种离子化技术:MALDI、解吸电喷雾电离(desorption electrospray ionization，DESI)、二次离子电离(secondary ion mass spectrometry，SIMS)。DESI为2004年提出的新型离子化技术，可在常压下使分析物电离。SIMS已于1960年被用于有机材料的分析，由于其检测质量范围的限制，直到近期才被用于生物学领域。

MALDI是一种温和的电离技术，1997年首次与成像方法结合，被应用于研究生物组织中分子的分布。在MALDI－IMS中，组织切片表面的分子需要与基质合理混合，当激光照射在组织切片表面时，基质吸收激光的能量而使分子发生解吸，解吸后的分子随基质一同进入气相状态，基质与分子发生质子转移反应后形成离子，随后经质谱检测，再由重构软件构建分子在组织中分布的谱图。应用该技术时，固定激光束的位置，通过改变载有组织的质谱靶的位置，就可以实现对整个组织的成像。该技术的空间分辨率受激光点直径和基质结晶尺寸等因素的影响，具有较大的盐容忍度和质量检测范围，电离产生的分子大部分以准分子离子形式(［M+H］+或［M－H］－)存在。MALDI可与多种质量分析器联用，如飞行时间(time of flight，TOF)、四级杆飞行时间(quadrupole time of flight，Q－TOF)、离子阱(ion trap，IT)和傅里叶变换离子回旋(Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR)等，其中，MALDI与TOF的联用较多。TOF具有较高的离子传输率(50%～100%)、较宽的质量范围和较好的重现性，但其质量准确性差。FTICR分析器具有超高的质量分辨率、准确性和稳定性，且具有串联质谱功能，能准确进行分子的定性分析。MALDI－ISM常用于药物及其代谢物、脂类、多肽和完整蛋白质的分析。

DESI于2004年被首次提出，是一种可在常压下使用的离子化技术，电喷雾产生的带电液滴作用于组织切片表面，在表面产生可溶解多种分子的次级带电液滴，离子化的分子在空气中直接进入质谱仪并测得m/z值，其气相离子的产生方式与电喷雾离子化技术相似，主要形成多电荷带电离子(［M+nH］n+或［M－nH］n－)。DESI可与线性离子阱(linear ion trap，LIT)和TOF等多种质量分析器联用。与MALDI相比，其空间分辨率(200～500μm)和灵敏度都较低，但其具有在常压下使用的优点，可有效保持分析物原来的某些特性。DESI－ISM主要用于脂类、药物及其代谢产物、植物中生物碱、水藻中抗菌分子等分布的研究。

SIMS技术已于1960年被用于有机材料的分析，由于其检测质量范围的限制，直到近期才被用于生物学领域。其原理是利用高能初级离子(如Ar+、Ga+、In+)撞击组织表面，使初级离子穿入样本表面并将动能传递给被分析的原子或分子，当原子或分子的动能大于与组织表面的相互作用能时，次级离子就从组织表面释放出来。该离子化技术包括静态和动态两种模式，前者的初级离子束能量低于1012 ions/cm2，主要与组织的单层分子作用，常用于定性分析;后者则使用强初级离子束，主要与组织的深层区域作用，对样本具有破坏性，常用于定量分析。采用SIMS技术时，样本处理过程简单，切片可直接转移至质谱靶而不需额外洗涤，减少了分子的损失和扩散。目前有两种样本处理方法可显著增强该技术次级离子产生的能力:一是将一层薄金属原子喷涂于组织表面，形成金属辅助SIMS(metal assisted SIMS，MetA－SIMS);二是将温和吸收能量的基质涂于组织表面，形成ME－SIMS。这两种方法均扩展了SIMS的质量检测范围，使其可用于脂类、多肽等生物分子分布的研究。SIMS－ISM具有较高的空间分辨率，但其质量检测范围较小，质荷比m/z超过1000时灵敏度会显著降低。

8.3.2.4　质谱分析方法

质谱分析方法是组织成像技术的核心，对组织表面进行直接的质谱分析不同于常规质谱分析，会遇到更多的挑战，如在组织成像实验中，组织表面的蛋白或者其他分子未经过分离，组织表面生理条件下存在的盐类及其他小分子等会对质谱分析产生干扰;或者随着被测分析物的相对分子质量增加，质谱的灵敏度和精确度会有一定程度的减弱，这要根据实际样品的需要对质谱条件进行优化。另外，离子抑制效应作为一种常见的质谱现象，在组织成像分析中尤其需要注意。当血红蛋白的丰度较高时，常常会抑制其他分子质量与之相近的分子的信号，一般应尽量使组织切片在制备时就避免和体内血液接触，以避免血红蛋白的干扰;但当血红蛋白处于相对低量时，可以用来作为内标对质量数进行校正。

质谱分析方法的优化主要通过质量扫描范围、栅电压及脉冲延迟时间、激光或离子束强度、谱图累积数、扫描步长等来实现，需要综合考虑所有因素，以获得更高质量的质谱图和成像图。

8.3.2.5　质谱图像的获得和重构

在进行质谱扫描之前，按所需要测定组织切片的大小，首先定义质谱扫描区域的尺寸。然后根据尺寸大小和实验所需要的图像分辨率将所检测的区域均分为若干点组成的二维点阵。在质谱仪中，激光束按前面设定好的自动扫描参数在软件控制下对组织切片进行连续的扫描，软件控制采集质谱数据，组织样品在激光束的激发下释放出的分子被质谱仪所鉴定，从而获得样品上每个点的质荷比(m/z)信息。

在每个样品点上，所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集组织切片的质谱数据，最后得到具有空间信息的整套组织切片的质谱数据，这样就可以完成对组织样品的“分子成像”。设定m/z的范围，并选定峰高或者峰面积来代表生物分子的相对丰度，即可形成该组织样品中各种生物分子相对应的空间分布质谱图像。

与一般光学成像类似，图像中的彩色斑点代表化合物的定位，每个斑点颜色的深浅与每一个点或像素上检测到的相应化学物分子质谱信号大小相关。选择组织图像上的任意一个斑点，图像都能够给出一个质谱谱图，代表在组织中这一部位中各种生物分子的分布信息。质谱分子成像技术是一种半定量或相对定量技术，图像上颜色深的部分表明有更多的生物分子聚集在组织的这个部分，并不能确定生物分子在组织的不同部位的实际绝对含量。

将不同切片位置的质谱信号转化为质谱图像，以及对图像中各区域进行统计分析，也是质谱成像技术中的一个重要环节。近年来，各质谱仪器厂商争相开发了适合本公司仪器的质谱成像配套软件，如布鲁克公司的Fleximaging系列软件，能方便地进行图像采集和数据处理。