黄酮类成分的体内分析

10.2.1.1　黄酮类化合物的结构与性质

黄酮类化合物(flavonoids)主要指基本母核为2－苯基色原酮类化合物，也泛指两个具有酚羟基的苯环(A环与B环)通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物(见图10－1)。

图10－1　黄酮类化合物的母核结构

根据中央三碳链的氧化程度、B环连接位置(2－或3－位)以及三碳链是否构成环状结构等特点，天然黄酮类化合物可以分为黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、黄烷－3，4－二醇类、双苯吡酮类、黄烷－3－醇类、异黄酮类、二氢异黄酮类、查尔酮类、二氢查尔酮类、橙酮类和高异黄酮类。此外，还有两分子黄酮或两分子二氢黄酮，或一分子黄酮和一分子二氢黄酮按C－C或C－O－C键方式连接而成的双黄酮类化合物。还有少量的结构很复杂的黄酮类化合物，如黄酮木脂体类化合物水飞蓟素和黄酮生物碱类化合物榕碱。

天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，其组成的糖类的种类、数量、连接位置以及连接方式各不相同，因而形成不同的黄酮苷。其组成的糖类包括单糖类(如D－葡萄糖、D－半乳糖、D－木糖、L－鼠李糖、L－阿拉伯糖、D－葡萄糖醛酸等)、二糖类(如槐糖、龙胆二糖、芸香糖、新橙皮糖等)、三糖类(如龙胆三糖)和酰化糖类(如咖啡酰基葡萄糖)等等。黄酮苷中苷元与糖的连接位置与苷元的结构类型相关，如黄酮醇类常形成3－、7－、3’－、4’－单糖苷或3，7－、3，4’－及7，4’－双糖链苷。除了O－糖苷外，天然黄酮类化合物中还有一些C－键苷，如中药葛根中的葛根黄素(puerarin)和知母中的芒果苷(mangiferin)。

黄酮苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有机溶剂。黄酮类化合物的羟基糖苷化后，水溶性相应加大，而在有机溶剂中的溶解度相应减少。黄酮苷易溶于水、甲醇、乙醇、醋酸乙酯、吡啶等溶剂，难溶于乙醚、三氯甲烷和苯等有机溶剂。黄酮类化合物因分子中有酚羟基，故具有一定的酸性。其酸性强弱与其所含酚羟基数目和位置相关。以黄酮为例，其酚羟基酸性强弱顺序为:

7，4’－二羟基＞7－或4’－羟基＞一般酚羟基＞5－羟基

黄酮类化合物由于结构里面含有2个苯环，有的黄酮类化合物其三碳链亦具有共轭体系，或者其中的双键与苯环中的作用，使共轭体系延长。因此，黄酮类化合物都具有较强的紫外吸收，这有利于应用高效液相色谱法进行黄酮类化合物的体内分析时采用紫外法进行检测。

10.2.1.2　黄酮类成分的体内分析方法的建立

要研究黄酮类成分在机体中的药代动力学行为，首先要建立黄酮类成分的体内分析方法。常用于黄酮类成分的体内分析方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱－质谱联用技术(LC－MS法)以及高效毛细管电泳法等。建立黄酮类成分的体内分析方法，根据研究对象(即要测定的成分)在生物样品中的浓度以及实验室的条件，结合要测定的黄酮类化合物的结构特点，具体问题具体分析，选择合适的体内样品测定方法。

1.高效液相色谱法

(1)概述:高效液相色谱法具有灵敏度高、选择性好、分离性能好、分析速度快、适用范围较广的特点。高效液相色谱法的最大的特点是方法建立好之后，重复性非常好。黄酮类成分由于具有较强的紫外吸收，这更有利于采用高效液相色谱法对黄酮类化合物进行体内分析。黄酮类化合物在体内能代谢形成多个产物，如葛根素在体内能代谢成大豆素、大豆素－7，4’－二－O－硫酸酯、大豆素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷和大豆素－4’－O－硫酸酯。这些产物结构相似，因此对黄酮类化合物的体内分析要寻找合适的色谱条件，消除这些代谢产物的干扰。黄酮类化合物分子中有酚羟基，具有一定的酸性，所以采用高效液相色谱法进行黄酮类化合物的体内分析时，要注意调整流动相的pH。采用高效液相色谱法对黄酮类成分进行体内分析常常采用反相高效液相法，紫外检测。对于生物样品中浓度很低的黄酮类成分采用高效液相色谱法分析时也可以考虑采用荧光检测，以提高方法的灵敏度。采用高效液相色谱法进行黄酮类成分的体内分析，其样品处理的方法有蛋白质沉淀法、液液萃取法和固液萃取法，其中蛋白质沉淀法简单快速，为常用方法之一，但要注意处理过程中防止要测定的药物成分与蛋白质一起共沉淀，导致回收率降低。各种样品处理方法详见前面的相关章节。

(2)应用实例

实例:高效液相色谱法测定大鼠血浆中汉黄芩苷的含量

汉黄芩苷(wogonoside)是中药黄芩中的主要成分之一，药理学研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、神经保护、自由基清除和抑制脑缺血后脑损伤作用。汉黄芩苷的结构见图10－2。邓远雄等采用外标法，建立了测定大鼠血浆中汉黄芩苷含量的高效液相色谱法。

①标准溶液的配制:将7 mg汉黄芩苷标准品溶于100 mL甲醇中制备浓度为mg·L－1的标准储备液。标准储备液储存于4℃备用。将标准储备液用甲醇稀释成浓度为1.09 mg·L－1、2.18 mg·L－1、4.37 mg·L－1、8.75 mg·L－1、17.5 mg·L－1、35.0 mg·L－1和70 mg·L－1的标准工作液。

②色谱条件:采用岛津Shimadzu 2010CHT高效液相色谱系统以及岛津CLASS－VP工作站。色谱柱为Hypersil C18柱(150 mm×5 mm，i.d.，5μm)，流动相组成为乙腈(A)和0.05%(v/v)磷酸(含5mmol·L－1的磷酸二氢钠)溶液(B)。采用梯度洗脱，洗脱程序为(B%):0～16 min，74.5%;16～19.5 min，74.5%～55%;19.5～21.5 min，55%～74.5%;21.5～26.5 min，74.5%。流动相在使用前经过0.45μm的滤膜真空抽滤并进行脱气处理。流速1.5 mL·min－1，操作温度40℃。

③样品处理:取100μL血浆样品，加入50μL KH2 PO4(1 mmol·L－1)溶液，涡旋混匀2 min，加入沉淀剂乙腈－甲醇(1 1，v/v)150μL，涡旋混匀10 min。20000 rpm高速离心20 min，取上清液20μL进样分析。

④标准曲线:取90μL空白血浆，加入10μL的上述浓度的标准工作液，配制浓度为0.109 mg·L－1、0.218mg·L－1、0.437mg·L－1、0.875mg·L－1、1.75mg·L－1、3mg·L－1和7 mg·L－1的标曲样品。标曲样品按上述方法进行处理，进样分析，以汉黄芩苷的峰面积对其浓度(外标法)进行回归，得到汉黄芩苷的标准曲线方程:Y=22827X－458.3(Y为峰面积，X为浓度)。相关系数(r2)为0.9999，表明其线性良好。

⑤方法专属性:将空白血浆、空白血浆加入汉黄芩苷标准品以及大鼠给予汉黄芩苷后的生物样品按上述方法进行处理分析，其色谱图见图10－3。由图可见，汉黄芩苷的保留时间为17.1 min，空白血浆在汉黄芩苷的峰位置没有干扰，表明其专属性良好。

⑥精密度和准确度:精密度试验，采用空白血浆制备汉黄芩苷低中高3个浓度(0.218 mg·L－1、0.875 mg·L－1、3.5 mg·L－1)的质控(QC)样品，用当日的随行标曲测定QC样品的浓度，每个浓度5个样本，连续进行3天，计算日内和日间的精密度(RSD%)和准确度(RE%)。结果见表10－1。

⑦讨论:在建立大鼠血浆中汉黄芩苷含量测定的高效液相色谱法的过程中，发现血浆样品处理如果不加入KH2 PO4溶液，那么样品的回收率低于60%。汉黄芩苷分子中含有酚羟基，具有一定的酸性，能与血浆蛋白结合。当血浆样品加入蛋白沉淀剂乙腈－甲醇混合物时，汉黄芩苷能与变性蛋白质一起形成共沉淀而沉淀下来，从而使其回收率降低。加入KH2 PO4溶液之后，KH2 PO4能阻断蛋白质与汉黄芩苷结合的位点，从而降低汉黄芩苷与血浆蛋白的结合，防止血浆蛋白沉淀时汉黄芩苷与蛋白质形成共沉淀，从而提高回收率。试验中还对其他蛋白质沉淀剂如乙腈、甲醇、6%高氯酸、10%三氯醋酸进行了实验，结果表明采用乙腈－甲醇(1 1，v/v)作沉淀剂时回收率最满意。

图10－2　汉黄芩苷的结构

图10－3　代表性的HPLC色谱图

(a)空白血浆;(b)汉黄芩苷标准品;(c)空白血浆加汉黄芩苷标准品;(d)大鼠灌胃给予汉黄芩苷后的血浆样品;1:汉黄芩苷

表10－1　HPLC法测定大鼠血浆中汉黄芩苷浓度的精密度和准确度

Cadded:加入浓度;Cmeasured:实测浓度。

2.液相色谱－质谱联用技术

(1)概述:液相色谱－质谱联用技术具有分离能力强、分析速度快、灵敏度高和能提供待测物质分子量的特点。黄酮类成分的LC－MS分析方法的建立从三方面着手。①对于黄酮类成分的生物样品的处理，其一般样品处理的注意事项见前面“高效液相色谱法”中的样品处理。在黄酮类成分的LC－MS法的建立中，由于一般沉淀去蛋白法有较多的缺点，如不容易将生物样品基质中引起基质效应的成分去除掉等。因此，在LC－MS法的样品处理中，液液萃取和固相萃取更为常用。有关液液萃取和固相萃取的具体方法见前面有关章节。②在黄酮类成分的LC－MS方法建立的液相色谱条件的选择环节，和前述高效液相色谱法的类似，注意黄酮类成分由于具有酚羟基，带有一定的酸性，因此要注意调整流动相的pH。总体来讲，由于LC－MS法中检测的是分子量，因此，LC－MS的色谱条件的选择比单纯的高效液相法中的色谱条件的选择要简单、容易，但要注意流动相中避免使用难挥发的无机酸和无机盐类。③黄酮类成分LC－MS分析的质谱条件的选择，包括离子源、分析模式、气体流速、锥体电压、离子源温度等等。由于黄酮类成分具有一定的酸性，极性较高，常选用ESI离子源。当然针对不同的黄酮类化合物，根据具体情况选用合适的离子源。黄酮苷元在负离子电喷雾质谱中的准分子离子［M－H］－的丰度较高，这是由于它们是一类多酚羟基化合物，具有一定的酸性。因此，在黄酮类成分的LC－MS分析中常用负离子模式。其余质谱分析参数如气体流速、锥体电压、离子源温度等根据待测物的不同在实验中进行优化。

(2)应用实例

实例:LC－MS法测定人血浆中灯盏花乙素的含量

灯盏花乙素(Scutellarin)是从中药短葶飞蓬［Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand－Mazz］或黄芩(skullcap)中提取的一种黄酮类成分，具有扩张血管、改善血流动力学、降低血液黏度、减少血小板计数和预防血小板聚集的药理作用，临床广泛用于治疗冠心病、心绞痛、血栓等心血管疾病。灯盏花乙素的结构见图10－4。Shen等采用黄芩苷(baicalin)作内标，建立了人血浆中灯盏花乙素含量测定的LC－MS法。

①LC－MS/MS条件:色谱分离采用Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5μm，迪马)，流动相A为0.1%甲酸，流动相B为甲醇。采用梯度洗脱，洗脱程序(A%):0～1.0 min，85%;1.01～9.0 min，40%;9.01～16.0 min，30%;16.01～18.0 min，85%。流动相流速为1.0 mL·min－1，柱温30℃。

质谱条件:选择正离子模式。定量采用选择性反应监测(SRM)方法，灯盏花乙素的跃迁为m/z 463.0→m/z 287.0，黄芩苷(内标，I.S.)的跃迁为m/z 447.0→m/z 271.0，每次跃迁的扫描时间为0.3秒。在质谱仪中进样灯盏花乙素和内标黄芩苷的标准溶液(1 mg·L－1)优化所有质谱参数。所得参数如下:喷雾电压为4.0kV，氮气作为屏蔽气(40psi)和辅助气(5 L·min－1)，毛细管温度为350℃。对于碰撞诱导解离(CID)，使用氩气作为碰撞气体，压力大约为1.5 mTorr。灯盏花乙素和内标黄芩苷的最佳优化碰撞能均选择12 eV。

②样品制备:固相萃取柱用2 mL甲醇和2 mL水活化。取1.0 mL血浆样品，加入1 mL 0.5%磷酸溶液，涡漩混匀1 min。然后将样品转移至固相萃取柱中，并且提供轻微吸力以便使样品以稳定的流速(约2mL·min－1)通过固相萃取柱。然后，用2 mL 0.5%的磷酸溶液洗涤固相萃取柱。最后，用2.0 mL甲醇洗脱萃取柱。收集的洗脱液，在40℃氮气吹干。残渣用100μL的流动相(甲醇水=7 3)复溶，并取20μL注入LC–MS/MS系统中进行分析。

图10－4　灯盏花乙素的结构

③标准样品和质量控制(QC)样品的制备:将灯盏花乙素溶于甲醇制备灯盏花乙素的贮备溶液，浓度为100 mg·L－1。将黄芩苷用于甲醇制备内标黄芩苷的贮备溶液，浓度为100 mg·L－1，并用甲醇稀释至200μg·L－1。将适量标准溶液加入空白血浆以制备标准曲线样品。标曲样品中灯盏花乙素的有效浓度为0.2μg·L－1、0.5μg·L－1、1μg·L－1、2μg·L－1、5μg·L－1、10μg·L－1、20μg·L－1。分别于空白血浆中加入灯盏花乙素，使浓度分别为1.0μg·L－1、5.0μg·L－1和10μg·L－1，制备质量控制样品(QC)。标准曲线样品和质量控制样品在每分析批次中连同未知样品一起按“样品制备”程序进行处理。

④标准曲线:采用灯盏花乙素与内标黄芩苷的峰面积比作为血浆样品的定量参数。将灯盏花乙素与内标的峰面积比对灯盏花乙素浓度作图得到标准曲线，且标准曲线的形式为Y=A+BX。本试验的标准曲线为:Y=0.1269X+0.0053(Y为灯盏花乙素与内标的峰面积比，X为灯盏花乙素的浓度)。分别在5天测定标曲样品以评价标曲的线性，结果表明其线性良好，相关系数r2＞0.999。定量范围为0.2～20.0μg·L－1，最低定量限为0.2μg·L－1。

⑤方法专属性:通过比较6批不同的空白血浆以及空白血浆加灯盏花乙素和内标黄芩苷样品的色谱图，发现血浆中的内源性物质没有明显的离子抑制效应，在灯盏花乙素和内标黄芩苷的色谱峰位置没有干扰。灯盏花乙素和内标黄芩苷的保留时间分别为10.0min和15.0min。代表性的色谱图见图10－5。

图10－5　代表性的人血浆样品中的灯盏花乙素(Ⅰ)和内标黄芩苷(Ⅱ)SRM色谱图

(a)空白血浆;(b)空白血浆加入灯盏花乙素和内标黄芩苷标准品;(c)志愿者口服灯盏花乙素4 h后的血浆样品

⑥精密度和准确度:通过在不同的时间(连续3天)测定3个浓度的QC样品(每个浓度5份)，计算精密度和准确度。准确度通过比较平均QC样品测定值与QC样品理论浓度，用相对误差(RE)表示:RE=(QC样品测定值－加入浓度)/加入浓度×100%。精密度用相对标准差表示，包括批内精密度和批间精密度。结果表明3个浓度批内精密度小于8.98%，3个浓度的批间精密度小于12.4%。3个浓度的RE均在±5.0%内。精密度和准确度符合要求。

⑦回收率和稳定性:3个水平(1.0μg·L－1、5.0μg·L－1、10.0μg·L－1)的灯盏花乙素和内标黄芩苷的绝对回收率通过测定3个浓度的QC样品以及将灯盏花乙素和黄芩苷直接溶解在空白血浆经处理的上清液中配置的样品，并比较他们的峰面积，计算绝对回收率。灯盏花乙素3个浓度的回收率分别为82.51±10.13%、85.18±6.62%和88.14±4.88%(n=5)。灯盏花乙素储备液的稳定性通过将储备液置于4℃冰箱中保存一周，然后测定。灯盏花乙素在血浆中的稳定性通过测定暴露于不同时间和温度条件下的QC样品(1.0μg·L－1、5.0μg·L－1、10μg·L－1)来评价。长期稳定性通过将样品于－20℃储存5天，然后测定。冻融循环稳定性通过测定连续5个冻融循环之后的样品进行评价。评价提取物储存稳定性将QC样品提取后保存5天然后分析测定，并与QC样品即时处理然后测定的结果进行比较，并计算出浓度偏差百分率。结果表明血浆样品在－20℃储存5天和经过5个冻融循环，样品中的灯盏花乙素没有明显的降解。5个冻融循环后3个浓度(1.0μg·L－1、5.0μg·L－1、10.0μg·L－1)的人血浆样品中的灯盏花乙素的准确度分别为108%、98.4%和97.5%。－20℃储存5天后，3个浓度(1.0μg·L－1、5.0μg·L－1、10.0μg·L－1)的人血浆样品中的灯盏花乙素的准确度分别为104%、103%和100%。灯盏花乙素溶于甲醇的储备液在4℃储存一周稳定，内标黄芩苷的甲醇溶液在4℃储存一周或在室温储存8个小时稳定。

⑧基质效应:为了评价基质效应也就是共洗脱的成分潜在的离子抑制或离子增强效应，5批不同的空白血浆用SPE进行萃取，并加入灯盏花乙素和内标配制3个浓度(1.0 ng·mL－1、5.0 ng·mL－1、10.0 ng·mL－1)的QC样品。把QC样品的峰面积(A)与用流动相稀释的相同浓度的标准品水溶液的相应的峰面积(B)进行比较，A/B×100%被定义为ME。ME等于100%表明灯盏花乙素在血浆提取物和在流动相里面的响应相同，没有绝对基质效应。ME＞100%表明离子增强，ME＜100%表明离子抑制效应。相对ME的评价通过直接比较目标分析物(灯盏花乙素)在不同来源的血浆中的峰面积的值。这些值的变异用RSD表示，是测定分析物(灯盏花乙素)相对ME的一种方法。结果表明本实验研究中没有绝对ME，各种浓度的RSD＜8.6%，表明其相对ME很小。