环烯醚萜类成分的体内药物分析

10.2.3.1　环烯醚萜类化合物的结构与性质

环烯醚萜(iridoids)为蚁臭二醛(iridoidial)的缩醛衍生物。从化学结构看，环烯醚萜是含有环戊烷结构单元、其性质具有一定特点的环状单萜衍生物。该类化合物具有环戊烷环烯醚萜(iridoid)和环戊烷开裂的裂环环烯醚萜(secoiridoid)两种基本骨架(见图10－11)。

图10－11　环烯醚萜类基本骨架

(a)环戊烷环烯醚萜;(b)裂环环烯醚萜

一般情况下，C4和C8有甲基取代，C3和C4间有双键，C1上多为羟基或甲氧基取代。1位羟基比较活泼，易与糖形成苷。环烯醚萜类化合物多以苷类形式存在，多为多为β－D－葡萄糖苷，且多为单糖苷，如栀子苷、京尼平苷、梓醇、桃叶珊瑚苷等等。自然界只有少量环烯醚萜类成分以苷元形式存在，如从列当科植物草苁蓉Boschniakia rossica(Cham.＆Schltdl.)B.Fedtsch中分离出的(4R)－4－羟甲基肉苁蓉内酯就是一种以苷元形式存在的环烯醚萜类化合物。C11有的氧化成羧酸，并可形成酯。

环烯醚萜类苷和裂环环烯醚萜苷大多数为白色(或无色)结晶体或粉末，多具有旋光性，味苦，具吸湿性。易溶于水和甲醇，可溶于乙醇、丙酮和正丁醇，难溶于乙醚、氯仿、苯等非极性有机溶剂。环烯醚萜苷易于水解，生成的苷元为半缩醛结构，其化学性质活泼，一般难以得到结晶苷元，苷元也能进一步分解和聚合。如地黄炮制变黑就是这个原因。苷元遇酸、碱、羰基化合物和氨基酸都能变色，利用这个性质可以将其衍生化，以利于测定。

10.2.3.2　环烯醚萜类成分的体内分析方法的建立

要研究环烯醚萜类成分在机体中的体内过程(即药代动力学行为)，首先要建立环烯醚萜类成分的体内分析方法。常用于环烯醚萜类成分的体内分析方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱－质谱联用技术(LC－MS法)等。建立环烯醚萜类成分的体内分析方法，根据研究对象(即要测定的成分)在生物样品中的浓度以及实验室的条件，结合要测定的环烯醚萜类化合物的结构特点，具体问题具体分析，选择合适的体内样品测定方法。

1.高效液相色谱法

(1)概述:环烯醚萜类成分采用高效液相色谱法进行体内分析时常用反相高效液相法。采用高效液相色谱法进行环烯醚萜类成分的体内分析时，对生物样品的处理有蛋白沉淀法、液液萃取法、固液萃取法等。选用什么样的生物样品处理方法要根据生物样品里面的环烯醚萜成分的化学性质及其浓度的高低，具体问题具体分析。如果生物样品中环烯醚萜类成分浓度比较高，可以采用蛋白沉淀法进行样品处理;如果其浓度较低，则可以采用固相萃取法。由于环烯醚萜类类药物多为苷类形式，易溶于水，所以液液萃取的样品处理方式较为少用。此外，环烯醚萜类成分由于分子中缺乏共轭系统，紫外吸收波长短，有时会干扰生物样品的测定，这种情况可以考虑采用衍生化法处理样品，将其中的环烯醚萜类成分衍生化之后进行测定。当然，也可以选用别的检测器，如蒸发光散射检测器(ELSD)。

(2)应用实例

实例:高效液相法测定大鼠血浆中栀子苷的浓度

栀子苷(geniposide)是一种从栀子等中药中提取分离得到的环烯醚萜类成分，其结构见图10－12。栀子苷具有利胆、保肝等作用。Ye等以芍药苷作为内标，建立了测定大鼠血浆中栀子苷含量的高效液相色谱法。

①色谱条件:采用Waters色谱系统，色谱柱为Diamonsil C18反相柱(5μm，200mm×4.6 mm)，外加一RP18(5μm)保护柱。流动相为水－乙腈(84 16，v/v)，使用前经0.45μm微孔滤膜过滤和超声脱气。流速为1.0 mL·min－1。

图10－12　栀子苷的结构

②样品处理:采用3 mL容量的C18固相小柱(Phenomenex)对样品血浆进行处理。固相小柱预先用3 mL甲醇洗脱2次和3 mL三蒸水洗脱2次，进行活化。将1 mL含内标的样品血浆上样，然后用3 mL三蒸水冲洗2次。然后用4 mL 60%甲醇在低真空下将栀子苷和内标洗脱下来。洗脱液40℃真空干燥，残渣用1 mL流动相溶解，20μL进样分析。

③标准曲线:将栀子苷和内标芍药苷分别溶液三蒸水制备储备液。将栀子苷储备液稀释成浓度为1 mg·L－1、4 mg·L－1、8 mg·L－1、12 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1、160 mg·L－1的标准溶液，芍药苷的标准溶液浓度为30μg·mL－1。将100μL的栀子苷和内标标准溶液加入一定量的空白血浆配制成一系列标曲样品，样品中内标芍药苷浓度为3 mg·L－1，栀子苷浓度为0.1 mg·L－1、0.4 mg·L－1、0.8 mg·L－1、1.2 mg·L－1、2.0 mg·L－1、4.0 mg·L－1、8.0 mg·L－1、16.0 mg·L－1。然后将血浆样品按上述方法处理。最低定量限(LOQ)是指标准曲线中精密度(RSD)小于10%的最低浓度。结果表明，标准曲线为Y=0.6317X－0.0550(r=0.9993)，LOQ为0.1 mg·L－1，最低检测限为(LOD为0.01μg·mL－1(S/N=3)。

④专属性:在上述色谱条件下，栀子苷和内标芍药苷能很好地分离，血浆中的其他内源性成分不干扰栀子苷的测定。代表性的色谱图见图10－13。栀子苷和内标的保留时间约为7.1 min和11.9 min。

图10－13　代表性的色谱图

(a)空白血浆;(b)空白血浆加入栀子苷(G)和内标(S)的标准品;(c)给药后血浆样品

⑤准确度和精密度:取空白血浆加入栀子苷标和内标标准品溶液配制QC样品，其浓度为0.1 mg·L－1、0.8 mg·L－1、2.0 mg·L－1、8.0 mg·L－1、16.0 mg·L－1(内标浓度为3 mg·L－1)，每个浓度5份。按上述样品处理方法处理，一天内测定，计算日内精密度(RSD);连续5天测定，计算日间精密度(RSD)。结果表明，日内精密度和日间精密度(RSD)均小于10%。根据QC样品的测得浓度和配制浓度，计算准确度。结果表明，栀子苷的准确度98.3%～100.3%。

⑥回收率:实验测定了浓度为0.4 mg·L－1、2.0 mg·L－1、8.0 mg·L－1的QC样品的回收率。空白血浆加入栀子苷和内标的标准品溶液配置含栀子苷浓度为0.4 mg·L－1和内标3 mg·L－1的QC样品(5份)(第一组)。样品按上述方法处理。第二组QC样品为空白血浆加入内标(3 mg·L－1)(5份)，按上述方法用固相小柱处理后，栀子苷加入到洗脱液中配制成0.4mg·L－1。回收率的计算:R=(第一组中的峰面积比/第二组中的峰面积比)×100%。其余两个浓度的回收率的测定方法相同。结果表明，平均回收率为92.8%。

2.液相色谱－质谱联用技术

(1)概述:很多环烯醚萜类成分如梓醇、地黄苷D等体内浓度很低，常规高效液相色谱法难以满足其测定要求，而LC－MS由于具有高灵敏度，能满足环烯醚萜类成分体内分析的要求。

环烯醚萜类成分的LC－MS分析方法的建立需从三方面着手。①对于环烯醚萜类成分的生物样品的处理，其一般样品处理的注意事项见前面高效液相色谱法建立中的样品处理。由于环烯醚萜类成分易溶于水，所以当采用LC－MS进行体内样品分析时，样品处理不能采用液液萃取。同时考虑到基质效应的影响，蛋白沉淀法也较少采用，可以考虑采用固相萃取法(SPE)。②环烯醚萜类的LC－MS方法建立的液相色谱条件的选择环节参照前面环烯醚萜类化合物的高效液相色谱法的建立，但要注意流动相中避免使用难挥发的无机酸和无机盐类。③环烯醚萜类成分LC－MS分析的质谱条件的选择，包括离子源、分析模式、气体流速、锥体电压、离子源温度等等。根据待测物质的具体情况，对各参数进行优化。

(2)应用实例

实例:液相色谱－电喷离子化质谱法测定大鼠血浆中梓醇的含量

梓醇是从地黄中提取得到的一种环烯醚萜类成分，其结构见图10－14。梓醇具有降低血糖、利尿、抗肿瘤、解痉和抗炎作用。由于梓醇的紫外吸收波长短，采用HPLC－UV进行梓醇的体内分析的灵敏度低。因此，Lu等采用桃叶珊瑚苷作内标，建立了测定大鼠血浆中梓醇含量的LC－MS方法。

图10－14　梓醇的结构

①LC－MS条件:色谱柱为Diamonsil C18柱(150mm×4.6 mm，5μm，迪马科技)。流动相为甲醇和10mM甲酸铵(30 70，v/v)组成，流速0.4 mL·min－1，柱温25℃。质谱条件:正离子模式，离子源使用的喷雾电压为4500V，保护气体和辅助气体为氮气(40 psi，5 L·min－1)，毛细管温度为320℃。碰撞气体(氩气)压强为0.8 m Torr。采用选择性反应监测(SRM)模式，梓醇的加铵母离子到子离子的跃迁为(m/z)380.1→183.0，碰撞能为15 eV;内标桃叶珊瑚苷的加铵母离子到子离子的跃迁为(m/z)364.3→167.0，碰撞能为15 eV(见图10－15)。总分析时间为6.5 min。

图10－15　梓醇(A)和内标(B)加铵母离子［M+NH4］+的子离子质谱图

②标准样品和质控样品的制备:将梓醇和内标分别溶于甲醇配制浓度为1.0 g·L－1的贮备液。用甲醇连续稀释梓醇贮备液以得到标准工作液，浓度分别为10μg·L－1、20μg·L－1、100μg·L－1、500μg·L－1、2000μg·L－1、10000μg·L－1和20000μg·L－1。同样通过使用甲醇稀释内标贮备液至浓度为2000μg·L－1以制备内标标准工作液。所有溶液置于4℃保存并在使用前放置至室温。标准样品的制备:用平缓稳定的氮气流于40℃将50μL工作液蒸干，然后加入50μL大鼠空白血浆，涡旋混匀30s。血浆中梓醇浓度范围为10～20000μg·L－1。质控样品(QC样品)的制备:用同样的方法制备低、中、高3个水平制备质控样品(浓度为20μg·L－1、500μg·L－1、16000μg·L－1)。所有标准样品和QC样品均按照样品处理方法进行处理。标准样品和质控样品均用于方法验证。

③样品处理:采用蛋白质沉淀处理大鼠血浆样品。50μL血浆样品于聚丙烯试管中加入50μL甲醇和100μL内标工作液(2000μg·L－1)。随后，将试管涡旋混合30s以沉淀血浆蛋白。然后于6000×g离心5 min。取150μL上清有机层转移至聚丙烯试管中并用150μL水稀释，涡旋混匀。然后将5μL等分的上清液注入到液相色谱/质谱/质谱联用系统中分析。将超过检测上限的样品(20000μg·L－1)用空白血浆稀释5倍。取50μL稀释后血浆样品采用同样的样品方法处理，然后重新分析。

④选择性:为研究内源性组分是否干扰测定，分析了6份不同的空白大鼠血浆样品以确定随内源性成分是否干扰梓醇和内标的分析。梓醇和内标的色谱峰以它们的保留时间和SRM响应为基础确定。结果表明，血浆内源性成分不干扰梓醇和内标桃叶珊瑚苷的测定，基线稳定。梓醇和内标的保留时间分别为4.4 min和5.0 min。代表性的图谱见图10－16。

⑤线性和最低定量限:为评价方法的线性，以空白大鼠血浆配制线性范围为10～20000 ng·mL－1的标准曲线样品一式3份，连续3天分析。通过以峰面积比(梓醇比内标)对梓醇浓度作图建立标准曲线。使用最小二乘法得到标曲图。通过加权因子为1/X2的线性回归分析评估线性。标曲样品的根据标曲计算得到的浓度与配制浓度的偏差小于15%(定量限的浓度点则为20%)，用相关系数和偏差(RSD)反应标曲在线性范围内的性能。结果表明，标准曲线为Y=3.535×10－4 X+9.841×10－4(r2=0.9904)，各浓度点的偏差(RSD)均小于15%。最低定量限(LLOQ)的精密度为20%和准确度为±20%的标准曲线的最低浓度点。结果表明本方法的最低定量限为10μg·L－1，在LLOQ时，其RSD小于10.2%，准确度的偏差在±1.9%内。

(6)精密度和准确度:将高、中、低3个浓度(20μg·L－1、500μg·L－1、16000μg·L－1)的QC样品(每个浓度6份)连续3天进行测定，评价日内和日间精密度。精密度的计算采用单方向方差分析(ANOVA)，以相对标准差(RSD)表示。准确度的测定通过计算QC样品测定的百分偏差，表示为相对误差(RE)。可以接受的日内和日间精密度及准确度应该在±15%以内。结果表明，日内和日间精密度分别小于6.3%和14.6%。日内和日间准确度分别在±4.8%和±5.6%以内。

如果给药后血浆样品的含量超出定量上限(20000μg·L－1)，那么需将样品以空白血浆稀释重新分析。因此要研究稀释后样品的精密度和准确度。方法:用空白血浆加入标准溶液配制浓度为80000μg·L－1的QC样品(6份)，将其用空白血浆稀释5次，照前述方法处理和测定，并将其结果与空白血浆加标准溶液直接配制的相同浓度的样品的测定结果进行比较，计算精密度和准确度，要求精密度和准确度在±15%以内。结果表明稀释样品的精密度均小于8.4%，准确度在±9.6%以内。

图10－16　梓醇和内标(IS)代表性的SRM色谱图

(a)空白血浆;(b)空白血浆加梓醇和内标的标准品;(c)大鼠给予梓醇后的血浆样品

⑦基质效应:基质效应指对分析物离子化的离子抑制/增强作用，通过对比提取后的加标样品以及被直接蒸干然后在流动相中复溶的标准溶液的相应的峰面积进行评价。实验在3种质控浓度下进行，质控样品一式3份。结果表明，3个浓度的基质效应为－5.1%～13%，基质效应不很明显，符合要求。

⑧回收率:回收率的测定通过比较血浆样品(3个浓度，每个浓度3份)按上述方法处理测定的峰面积与相同浓度的标准溶液直接测定的峰面积，计算其回收率。结果表明，血浆样品中梓醇的回收率为76.5±5.2%，且几个浓度回收率一致。内标的回收率为78.9±7.3%。

⑨稳定性:梓醇的稳定性通过比较高、中、低3个浓度的测得浓度与配制浓度来评价。用平缓稳定的氮气流于40℃将50μL工作液蒸干，然后加入50μL大鼠空白血浆，涡旋混匀30 s，然后根据以下4种储存条件进行保存:a.样品制备中梓醇的稳定性通过测定样品室温储存4h后的浓度来评价;b.对于冻融稳定性，过测定3个冻融循环(－20℃→0℃)的样品浓度来评价;c.评价样品处理后在自动进样器中的稳定性，将血浆样品处理后在自动进样器(4℃)中放置12h，然后进样测定;d.长期稳定性通过测定－20℃保存30天的样品来评价。所有这些样品的分析与新鲜配制的标准曲线样品一起进行，如果梓醇的百分偏差在±15%以内，则认为梓醇稳定。结果表明，梓醇血浆样品经过3个冻融循环或－20℃保存30天或室温储存4 h，梓醇都稳定。血浆样品处理后在自动进样器放置12 h后，梓醇稳定，因此可以在一个分析周期内分析大量样品。