香豆素类成分的体内药物分析

10.2.4.1香豆素类化合物的结构、种类与性质

香豆素(coumarins)又称香豆精，为顺式邻羟基桂皮酸的内酯，具特异香气，其典型结构式如图10－17。

图10－17　香豆素的结构

香豆素与糖结合性冲动苷叫香豆素苷(coumarin glycosides)。香豆素以游离状态或其苷类的形式存在于生物体内。

香豆素类化合物按香豆素母核的取代基不同分为:羟基香豆素类，如七叶苷、东莨菪苷、瑞香内酯等;呋喃香豆素类，如补骨脂内酯、白芷素等;吡喃香豆素类，如白花前胡甲素、花椒内酯等;双香豆素类，如双七叶内酯;双氢异香豆素类，如岩白菜内酯等。

游离的香豆素多为无色结晶，味苦，具特异香气，小分子香豆素能升华，而大多数香豆素苷无香气，也不能升华。香豆素苷能溶于水、甲醇、乙醇与碱液，难溶于乙醚、苯等有机溶剂;苷元难溶于冷水，能溶于沸水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚及碱液。某些香豆素类化合物有荧光，在碱性溶液中更显著，荧光的有无与分子中的取代基的种类和位置有关，如7－羟基香豆素有强烈的蓝色荧光，而7，8－二羟基香豆素则没有荧光。香豆素类化合物分子中有苯环及共轭体系，因此有较强的紫外吸收，这有利于采用HPLC－UV法进行测定。

10.2.4.2香豆素类成分的体内分析方法

香豆素类成分具有广泛的药理活性，因此了解香豆素类成分在体内的药代动力学行为具有重要意义。要研究这些化合物的药代动力学，首先必须建立其生物样品特别是血中浓度的分析方法，即其体内分析方法。常用于香豆素类成分的体内分析的方法有高效液相色谱法和液相色谱－质谱联用技术。至于具体采用什么方法进行分析，要根据生物样品中待测药物的浓度和实验室的条件，具体问题具体分析，选择合适的方法。

1.高效液相色谱法

(1)概述:香豆素类药物由于其分子中具有苯环和共轭系统，其紫外吸收较强，有利于采用HPLC－UV法进行分析。而且，部分香豆素类成分由于具有荧光，可以采用荧光检测，有利于提高其灵敏度。采用HPLC－UV方法进行香豆素类成分的体内分析时，其样品处理可以采用蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法。实验中根据生物样品中待测药物的具体情况，选择合适的样品处理方法。如果采用荧光检测，要注意细心操作，避免实验过程的荧光物质的污染，干扰测定。

(2)应用实例

实例:高效液相色谱法测定大鼠血浆中七叶苷的含量

七叶苷(aesculin，AN)是从中药秦皮中提取的一种香豆素类成分，其结构见图10－18。研究表明，七叶苷具有抑制黄嘌呤氧化酶、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗过敏、中枢抑制和解热作用。临床用于治疗细菌性痢疾、气管炎等疾病。Chen等采用甲硝唑作为内标(IS)建立了测定大鼠血浆中七叶苷含量的高效液相色谱法。

图10－18　七叶苷的结构

①色谱条件:采用安捷伦HP1100色谱仪，色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5μm)(Dikma)，并外加一ODS保护柱(10 mm×4.0 mm i.d.，5μm)。流动相为乙腈－0.1%三乙胺溶液(磷酸调pH至3.0)，使用前用0.22μm纤维膜过滤，流速1.0 mL·min－1，进样体积为20μL，每次进样分析时间15 min，柱温30℃，检测波长338 nm。

②标曲样品和质控样品的制备:将七叶苷(AN)和内标(IS)甲硝唑的标准品精密称定，用甲醇溶解，制备AN和IS的储备液，其浓度分别为61.24μg·mL－1和50 mg·L－1。储备液储存于4℃，临用前放至室温。将AN储备液用5%甲醇稀释制备浓度为0.57～30.62 mg·L－1的AN标准溶液。将IS的储备液用水稀释至浓度为5.0 mg·L－1的内标溶液。取空白血浆，分别加入AN标准溶液，配制浓度为57.4μg·L－1、95.7μg·L－1、191.4μg·L－1、382.8μg·L－1、765.5μg·L－1、1531.0μg·L－1、3062.0μg·L－1的标曲样品。将AN标准溶液分别加入空白血浆中，配制浓度分别为57.4、67.0、114.8、765.5、2449.6μg·L－1的质控(QC)样品。QC样品分装成100μL，密闭保存于－20℃。

③样品处理:将100μL样品(标曲样品、QC样品或实际样品)加入100μL内标溶液，涡旋混匀5min，加入480μL甲醇，涡旋10 min。然后12000 rpm离心20 min，取上清液置于玻璃试管中，40℃氮气吹干，残渣用100μL流动相复溶，12000 rpm离心20min，取20μL进样分析。

④专属性:在上述色谱条件下，血浆中的内源性成分不干扰AN和内标的测定。AN和IS的保留时间分为约10.2 min和12.8 min。代表性色谱图见图10－19。

图10－19　代表性的色谱图

(a)空白血浆;(b)AN和IS标准品;(c)空白血浆加AN和IS标准品;(d)大鼠给药后的血浆样品;
峰1—AN;峰2—IS

⑤标准曲线及其线性:将标曲样品按前述样品处理方法进行处理，进样分析，以AN与IS的峰面积比对AN的浓度作图，以最小二乘法回归建立标曲。最低定量限定义为相对标准差(RSD)小于20%，准确度在80%～120%间的最多浓度。结果表明，标曲为Y=(595.27)X+9.10(r2=0.999)。最低定量限为57.4μg·L－1，最低检测限为24.0μg·L－1(S/N=3)。

⑥精密度和准确度:将QC样品(浓度为57.4μg·L－1、67.0μg·L－1、114.8μg·L－1、765.5μg·L－1、2449.6μg·L－1)按上述方法在一天内处理，进样分析，计算日内精密度(RSD)和准确度;将QC样品在连续3天内处理进样分析，计算日间精密度(RSD)和准确度。结果表明，日内精密度(RSD)为2.13%～10.2%，准确度为94%～115.2%。日间精密度(RSD)为6.38%～12.4%，准确度为91.1%～108.6%。

⑦回收率:配制浓度为114.8μg·L－1、765.5μg·L－1和2449.6μg·L－1(每个浓度3份)的QC样品，按上述方法处理，进样分析;同时将相应浓度的标准溶液进样分析，比较它们的峰面积，计算绝对回收率。结果表明，114.8μg·L－1、765.5μg·L－1和2449.6μg·L－1的平均回收率分别为91.8%、93.9%、96.0%。内标的平均回收率为92.7%。

⑧稳定性:QC样品用来评价不同条件下的稳定性。将QC样品室温放置24 h然后与解冻的QC样品按上述方法处理分析，比较其结果，评价其室温保存稳定性。将QC样品经过3个冻融循环后处理分析，评价其冻融稳定性;将QC样品－20℃分别放置0 d、5 d、10 d、30 d，然后处理分析，评价其长期稳定性。相对于标示浓度的回收率为90%～110%者被认为是稳定的。结果表明，AN储备液在4℃保存2个月稳定，QC样品中AN至少在10 d内是稳定的，在血浆样品至少7 d稳定。样品室温放置24h稳定，与初始的浓度比较，其回收率为93.8%～98.2%。AN在样品经3个冻融循环后稳定。提取后的样品室温在流动相中24 h内稳定。

2.液相色谱－质谱联用技术

(1)概述:香豆素类成分体内分析的LC－MS法的建立从下面3方面考虑。①样品处理:由于香豆素类成分在体内以游离形式或苷的形式存在，而游离的香豆素类成分具有一定的脂溶性，可以采用液液萃取法进行体内生物样品处理。如果以苷的形式存在，由于其水溶性大，则可以采用固相萃取法进行样品处理。也可以采用蛋白沉淀法，其特点是简单便捷。②色谱条件:测定体内生物样品中香豆素类成分的LC－MS法，其色谱条件的选择可以参照高效液相色谱法中的方法，根据待测生物样品中香豆素类成分的结构性质选择色谱条件。③质谱条件:质谱条件的选择包括离子源、分析模式、气体流速、锥体电压、离子源温度等等。根据待测物质的具体情况，对各参数进行优化。部分香豆素类成分的苯环上有羟基，呈一定的酸性，因此这部分香豆素化合物的LC－MS分析才采用负离子模式。此外，香豆素类化合的质谱中，其基峰常为分子离子失去CO后的离子峰。建立香豆素类成分的LC－MS体内分析方法时，根据这些特点，优化质谱条件。

(2)应用实例

实例:液相色谱－质谱法测定人血浆中岩白菜素的含量

岩白菜素(bergenin)是从岩白菜、索骨丹等中药中提取的一直香豆素类成分，其结构见图10－20(a)。研究表明，岩白菜素具有抗炎作用、止咳作用、镇痛作用、抗心律失常作用、肝保护作用和神经保护作用。Yu等采用5－溴－2，4－嘧啶二酮(5－BrU)作为内标，建立了人血浆中岩白菜素含量测定的LC－MS法。

①标准溶液与质控溶液的制备:将25mg岩白菜素溶于50%乙腈水溶液(v/v)以制备岩白菜素贮备液(1 g·L－1)。用50%乙腈水溶液稀释贮备液以制备岩白菜素标准溶液(浓度为6μg·L－1、20μg·L－1、60μg·L－1、200μg·L－1、600μg·L－1和2000μg·L－1)。质控溶液(浓度为20μg·L－1、200μg·L－1和1600μg·L－1)采用同法分别制得。将内标5－BrU溶于乙腈制备内标贮备液(1 g·L－1);将内标储备液用50%乙腈水溶液稀释以制备内标工作液(0.5 mg·L－1)。所有溶液均置于4℃保存。

图10－20　岩白菜素(a)和内标5－BrU(b)的结构及其［M－H］－离子的子离子全扫描

②样品处理:取200μL的血浆样品，加入50μL内标工作液，100μL乙腈水溶液(50 50，体积比)及500μL乙腈。混合液涡旋混合30s后15000×g离心10min。上清液转移至10 mL玻璃试管中后加入100μL水和3.0 mL二氯甲烷。涡旋混合30 s后3500×g离心5 min，取上清液(水层)20μL注入液质联用系统进行分析。加入二氯甲烷洗不仅能除去乙腈，还减少了来自内源性物质的干扰，且不会损害岩白菜素的回收率。

③LC－MS条件:色谱柱为Zorbax SB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm，Agilent，USA)，柱温30℃。流动相为乙腈:10mM醋酸铵(1%甲酸)(20 80，v/v)，流速为1.0 mL·min－1。质谱条件:采用电喷雾离子源，负离子模式运行。采用单位分辨率下的多重反应监测模式(MRM)，监测岩白菜素的去氢分子离子的跃迁即m/z 326.9→312.3(定量离子)和326.9→234.1(定性离子)(岩白菜素［M－H］－离子精确质量为327.072156)，以及5－BrU的去氢分子离子的跃迁即m/z 188.9→m/z 42.2(见图10－20)。最优化的质谱参数为:气帘气体，气体1和气体2(氮气)分别为15，45和60单位;采样时间200 ms;离子喷雾电压－4000 V;源温度500℃;岩白菜素的去簇电压为－72V，5－BrU的去簇电压为－45V。岩白菜素的碰撞能为－23eV(m/z 326.9→312.3)和－20 eV(m/z 326.9→234.1)，而5－BrU的碰撞能为－35 eV。

④标准曲线及线性:将空白血浆分别加入岩白菜素标准溶液，配制一系列的标曲样品，按上述方法处理，进样分析，将岩白菜素和内标的峰面积比与岩白菜素的浓度进行权重回归分析(1/X2)，建立标准曲线，其标曲为Y=0.00412X+0.00265，r＞0.998，线性范围为3～1000μg·L－1。

⑤专属性:在上述LC－MS条件下，血浆内源性成分不干扰岩白菜素和内标的测定，代表性的色谱图见图10－21。岩白菜素和内标的保留时间分别为2.01 min和1.92 min。

图10－21　岩白菜素和内标在人血浆中代表性的色谱图

(a)空白血浆;(b)空白血浆加岩白菜素和内标标准品;(c)给药后人血浆样品
峰1为岩白菜素;峰Ⅱ为内标

⑥精密度、准确度、最低定量限和最低检测限:日内精密度和日间精密度及准确度通过连续3天测定3个浓度(每个浓度6份)的QC样品来评价。精密度用相对标准差(RSD)表示，准确度用相对误差(RE)表示。最低定量限(LLOQ)定义为精密度和准确度均小于不大于20%的最低浓度。结果表明，日内精密度(RSD)为3.94%～5.06%;日间精密度(RSD)为1.62%～8.31%。准确度(RE)为－2.33%～1.16%。LLOQ为3μg·L－1。

⑦回收率:配制3个浓度血浆QC样品，按上述样品处理方法进行处理，进样分析;将空白血浆按上述样品处理方法处理，提取液加入标准品，分别配制与3个血浆QC样品相同浓度的样品，进样分析。将其峰面积与相应浓度的血浆QC样品分析得到的峰面积比较，计算回收率。结果表明，岩白菜素浓度为10μg·L－1、100μg·L－1、800μg·L－1时的回收率分别为90.9±5.8%、88.0±7.1%和87±7.4%。

⑧稳定性:将QC样品按下述条件储存，然后按上述样品处理方法处理，进样分析，测定其稳定性。储存条件包括:室温储存6 h，－80℃储存10 d～18 d，3个冻融循环。此外，对处理好的样品在进样器中放置12 h后的稳定性也进行了测定。结果表明，当未加入维生素C时，处理后的质控样品中的岩白菜素在6 h后随时间显著减少;当加入维生素C后，处理后的质控样品中的岩白菜素至少12 h内能保持稳定;然而，即使加入了维生素C，QC样品在－80℃下保存超过10 d，样品将不稳定。