中药配伍研究

10.3.3.1　概述

中医治病讲究辨证论治，中药复方是中医辨证论治理论的具体体现，中药复方是中医用药的主要形式，而配伍是中药复方的核心。对中药复方的配伍机制研究是中药现代研究的核心内容之一。中药配伍机制复杂，中药配伍后由于配伍药味的成分的相互作用(理化作用)可能影响复方中药成分的溶出，甚至形成新的化学成分。中药配伍后各成分间可能发生药代动力学相互作用，影响中药成分进入机体内从而表现出配伍对疾病临床疗效的影响。当然，中药配伍对临床疗效的影响还可能是由配伍中药有效成分之间的药效学相互作用所引起的。中药配伍研究的方法有成分分析法、中药药理学研究方法、血清药物化学法和药代动力学研究方法。成分分析法通过分析中药配伍对各药味中的成分变化(包括质和量的变化)的影响来研究其配伍机制。药理学研究方法通过研究配伍对药理作用的影响来研究其配伍机制，包括全方研究法和拆方研究法。血清药物化学方法通过研究配伍对进入血清中的中药成分谱的影响来研究中药复方的配伍机制。药代动力学方法则通过研究配伍对中药成分药代动力学行为的影响来研究中药复方的配伍机制。采用血清化学方法和药代动力学方法研究中药的配伍机制，均需分析体内中药成分含量的变化，这就需要建立灵敏、准确的中药复方成分的体内分析方法。因此，中药的体内药物分析在中药配伍研究中具有重要意义。在中药配伍研究中，中药成分体内分析的内容包括生物样品的处理、色谱条件和检查条件的选择等等。建立这些分析方法的要求参见前面中药药代动力学研究的相关内容。在中药配伍研究中常用的体内分析方法包括高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、液相色谱－质谱联用技术等等。

实例:枳壳的不同配伍对枳壳成分柚皮苷和新橙皮苷药代动力学的影响

枳壳(ZQ)是一味常用中药，具有破气、行痰、消积的功效。现代药理学研究表明，其具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗增殖、抗菌作用。中成药胃肠安丸由枳壳、大黄、巴豆霜、木香、沉香等10味中药组成，临床用于治疗腹泻、肠炎、菌痢、脘腹胀满、腹痛、食积乳积等。Zhang等通过研究枳壳与大黄(DH)、巴豆霜(BD)配伍对枳壳中有效成分柚皮苷(naringin)和新橙皮苷(neohesperidin)在大鼠体内药代动力学的影响来探讨枳壳与大黄、巴豆霜的配伍机制。

(1)色谱条件:色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5μm)，保护柱为C18保护柱(7.5 mm×4.6 mm i.d.，5μm)。流动相为乙腈－1%醋酸(20 80)，流速为0.6 mL·min－1。柱温35℃，检测波长280nm。

(2)样品处理:取100μL血浆样品加入10μL的芦丁(内标，浓度为17.7 mg·L－1)溶液，涡旋混匀，加入1mL的乙酸乙酯，涡旋振荡3 min，10000 rpm高速离心5 min，取上清液氮气45℃吹干，残渣用100μL流动相复溶，15000 rpm离心5min，取10μL进样分析。结果表明，采用这种方法处理，在上述色谱条件下，柚皮苷、新橙皮苷、内标芦丁分离良好，内源性物质不干扰它们的分析(见图10－26)。

图10－26　HPLC色谱图

(a)空白血浆;(b)空白血浆加标准品和内标;(c)大鼠给予ZQ提取物后的血浆样品;
(d)大鼠给予ZQ–DH提取物后的血浆样品;(e)大鼠给予ZQ–BD提取物后的血浆样品;
(f)大鼠给予ZQ–DH–BD提取物后的血浆样品
1—内标;2—柚皮苷;3—新橙皮苷

(3)方法确证:将柚皮苷和新橙皮苷标准品加入空白血浆，配置柚皮苷的浓度为0.0177 mg·L－1、0.0354 mg·L－1、0.708 mg·L－1、0.142 mg·L－1、0.283 mg·L－1、0.566 mg·L－1、1.133 mg·L－1、2.266 mg·L－1、4.531 mg·L－1和新橙皮苷浓度为0.0105 mg·L－1、0.0210 mg·L－1、0.0420 mg·L－1、0.0840 mg·L－1、0.168 mg·L－1、0.336 mg·L－1、0.672 mg·L－1、1.344 mg·L－1、2.688 mg·L－1的标准样品，按上述样品处理方法处理，进样分析，以柚皮苷与内标的峰面积比对柚皮苷浓度回归分析得到柚皮苷的标准曲线;以新橙皮苷与内标的峰面积比对新橙皮苷的浓度回归分析得到新橙皮苷的标准曲线。结果表明，柚皮苷和新橙皮苷在定量范围内线性良好。配制柚皮苷浓度为0.0354 mg·L－1、0.283 mg·L－1、2.266 mg·L－1和新橙皮苷浓度为0.0210 mg·L－1、0.168 mg·L－1、1.344 mg·L－1的质控(QC)样品。采用3个浓度的QC样品测定方法的精密度、准确度、回收率和稳定性。日内精密度和日间精密度分别通过在一天内和连续3天内分析3个浓度的质控样品进行测定。准确度通过测定其回收率进行评价。稳定性通过分析经过3个冻融循环的样品进行评价。结果表明，柚皮苷和新橙皮苷的回收率分别为85.224%和91.328%，柚皮苷和新橙皮苷的日内和日间的准确度在92.342%～106.483%，相对标准差(RSD)小于10.974%。稳定性分析表明样品具有良好的稳定性。

(4)药代动力学研究:24只大鼠分为4组，每组6只，分别灌胃ZQ、ZQ－DH、ZQ－BD、ZQ－DH－BD提取物，分别于给药后0.083 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h眼眶静脉丛取血，以肝素化离心管收集，每次取血200μL，10000 rpm离心，取血浆保存于－20℃待测。

血浆中柚皮苷和新橙皮苷浓度用随行标准曲线估算，血浆药物浓度－时间数据用3P97软件分析。参数Cmax和Tmax直接从实测数据直接得到，末端消除速率常数(ke)采用最小二乘法对血浆药物浓度－时间曲线的末端进行回归分析得到。消除半衰期(T1/2)=0.693/ke。曲线下面积(AUC)采用梯形法计算。给药后大鼠血浆中柚皮苷和新橙皮苷的药物浓度－时间曲线见图10－27。枳壳(ZQ)和巴豆霜(BD)配伍后(ZQ－BD组和ZQ－DH－BD组)，血浆中柚皮苷和新橙皮苷的Cmax和AUC显著增加(见图10－28)。ZQ－BD组的柚皮苷的Cmax比ZQ组高2.28倍，新橙皮苷的Cmax比ZQ组高4.95倍;ZQ－BD组的柚皮苷的AUC比ZQ组高1.95倍，新橙皮苷的AUC比ZQ组高2.56倍。而枳壳(ZQ)和大黄(DH)配伍，血浆中柚皮苷和新橙皮苷的药代动力学参数则没有这种改变。结果说明，枳壳和巴豆霜配伍后，枳壳的成分柚皮苷和新橙皮苷的生物利用度增加，这可能是巴豆霜中的某些成分促进了柚皮苷和新橙皮苷的吸收，而大黄中的成分则不影响枳壳成分柚皮苷和新橙皮苷的吸收。因此，从枳壳与大黄、巴豆霜的配伍对柚皮苷、新橙皮苷的药代动力学的影响可以阐明枳壳与大黄和巴豆霜的配伍机制，即枳壳与巴豆霜的配伍可以增加有效成分的生物利用度，有助于药效的增强。

图10－27　大鼠灌胃ZQ、ZQ－DH、ZQ－BD、ZQ－DH－BD提取物后血浆中柚皮苷(a)和新橙皮苷(b)的浓度

图10－28　大鼠给予ZQ、ZQ－DH、ZQ－BD、ZQ－DH－BD提取物后血浆中柚皮苷和新橙皮苷的Cm ax和AUC参数的比较

【思考题】

1.简述黄酮类化合物结构中酚羟基的酸性特点，建立测定分析黄酮类成分的高效液相色谱法时应该如何利用这一特点?

2.采用LC－MS进行黄酮类成分的体内分析时，如何选择离子源?

3.生物碱类成分有什么特点?采用高效液相色谱进行生物碱类成分的体内分析时如何利用其特性?

4.建立分析生物样品中的生物碱类成分的LC－MS方法时应该注意哪些方面?

5.环烯醚萜类成分的紫外吸收特点如何?采用高效液相色谱法进行环烯醚萜类成分的体内分析时要注意哪些方面?

6.建立香豆素类成分的LC－MS分析方法时要考虑哪些方面?

7.体内药物分析方法在中药研究中的应用有哪些?