新药非临床药物代谢动力学研究的基本要求与内容

12.1.2.1　基本原则

进行非临床药代动力学研究，要遵循以下基本原则:试验目的明确、试验设计合理、分析方法可靠、所得参数全面、满足评价要求、对试验结果进行综合分析与评价、具体问题具体分析。

12.1.2.2　试验设计总体要求

1.受试物

受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。受试物应注明名称、来源、批号、含量(或规格)、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。

2.试验动物

一般采用成年和健康的动物。常用动物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬、小型猪和猴等。动物选择的一般原则如下:

①首选动物:尽可能与药效学和毒理学研究一致，并兼顾与人体的相关性。②尽量在动物清醒状态下进行试验，动力学研究最好从同一动物多次采样。③创新性的药物应选用2种或2种以上的动物，其中一种为啮齿类动物;另一种为非啮齿类动物(如犬、小型猪或猴等)。其他药物，可选用一种动物，建议首选非啮齿类动物。④经口给药不宜选用兔等食草类动物。

3.剂量选择

动物药代动力学研究应设置至少3个剂量组，其高剂量最好接近于最大耐受剂量，中、小剂量根据动物有效剂量的上下限范围选取。主要考察在所选剂量范围内，药物的体内动力学过程属于线性还是非线性，以利于解释药效学和毒理学研究中的发现，并为新药的进一步开发和研究提供信息。

4.给药途径

所用的给药途径和方式，应尽可能与临床用药一致。

12.1.2.3　研究内容

1.血药浓度－时间曲线

(1)受试动物数:以血药浓度－时间曲线的每个采样点一般不少于6个数据为限计算所需动物数。建议受试动物采用雌雄各半，如选择单一性别，应说明理由。

(2)采样点:采样点的确定对药代动力学研究结果有重大影响，若采样点过少或选择不当，得到的血药浓度－时间曲线可能与药物在体内的真实情况产生较大差异。给药前需要采血作为空白样品。为获得给药后的完整的血药浓度－时间曲线，采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相(峰浓度附近)和消除相。一般在吸收相至少需要2～3个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度(Cmax);在Cmax附近至少需要3个采样点;消除相需要4～6个采样点。整个采样时间至少应持续到3～5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10～1/20。为保证最佳采样点，建议在正式试验前进行预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。

(3)口服给药:一般在给药前应禁食12 h以上，以排除食物对药物吸收的影响。另外在试验中应注意根据具体情况统一给药后的禁食时间，以避免由此带来的数据波动及食物的影响。

(4)药代动力学参数:根据试验中测得的各受试动物的血药浓度－时间数据，求得受试物的主要药代动力学参数。静脉注射给药，应提供t1/2(消除半衰期)、Vd(表观分布容积)、AUC(血药浓度－时间曲线下面积)、CL(清除率)等参数值;血管外给药，应提供Cmax和Tmax(达峰时间)、t1/2(消除半衰期)等参数，以反映药物吸收、消除的规律。另外，提供统计矩参数，如:MRT(平均滞留时间)、AUC0－t和AUC0－∞等，对于描述药物药代动力学特征也是有意义的。

(5)多次给药:对于临床需长期给药且有蓄积倾向的药物，应考虑进行多次给药的药代动力学研究。多次给药试验时，一般可选用一个剂量(有效剂量)。根据单次给药药代动力学试验结果求得的消除半衰期，并参考药效学数据，确定药物剂量、给药间隔和给药天数。

(6)应提供的数据:

①单次给药:各个(和各组)受试动物的血药浓度－时间数据及曲线和其平均值、标准差及曲线;各个(和各组)受试动物的主要药代动力学参数及平均值、标准差;对受试物单次给药非临床药代动力学的规律和特点进行讨论和评价。

②多次给药:各个(和各组)受试动物首次给药后的血药浓度－时间数据及曲线和主要药代动力学参数。各个(和各组)受试动物的3次稳态谷浓度数据及平均值、标准差。各个(和各组)受试动物血药浓度达稳态后末次给药的血药浓度－时间数据和曲线，以及其平均值、标准差和曲线。比较首次与末次给药的血药浓度－时间曲线和有关参数。各个(和各组)平均稳态血药浓度及标准差。对受试药物多次给药非临床药代动力学的规律和特点进行讨论和评价。

2.吸收

对于经口给药的新药，应进行整体动物试验，尽可能同时进行血管内给药的试验，提供绝对生物利用度。如有必要，可进行体外细胞试验、在体或离体肠道吸收试验以阐述药物吸收特性。对于其他血管外给药的药物及某些改变剂型的药物，应根据立题目的，尽可能提供绝对生物利用度。

3.分布

选用大鼠或小鼠做组织分布试验较为方便。通常选择一个剂量(一般以有效剂量为宜)给药后，至少测定药物及主要代谢物在心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、生殖腺、脑、体脂、骨骼肌等组织的浓度，以了解药物在体内的主要分布组织。特别注意药物浓度高、蓄积时间长的组织和器官，以及在药效或毒性靶器官的分布(如对造血系统有影响的药物，应考察其在骨髓的分布)。必要时建立和说明血药浓度与靶组织药物浓度的关系。参考血药浓度－时间曲线的变化趋势，选择至少3个时间点，分别代表吸收相、平衡相和消除相的药物分布。若某组织的药物浓度较高，应增加观测点，进一步研究该组织中药物消除的情况。每个时间点，至少应有6个动物的数据。

以下情况可考虑进行多次给药后特定组织的药物浓度研究:

(1)药物/代谢物在组织中的半衰期明显超过其血浆消除半衰期，并超过毒性研究给药间隔的2倍。

(2)在短期毒性研究、单次给药的组织分布研究或其他药理学研究中观察到未预料的，而且对安全性评价有重要意义的组织病理学改变。

(3)定位靶向释放的药物。

进行组织分布试验，必须注意取样的代表性和一致性。

同位素标记物的组织分布试验，应提供标记药物的放化纯度、标记率(比活性)、标记位置、给药剂量等参数;提供放射性测定所采用的详细方法，如分析仪器、本底计数、计数效率、校正因子、样品制备过程等;提供采用放射性示踪生物学试验的详细过程，以及在生物样品测定时对放射性衰变所进行的校正方程等。

4.排泄

(1)尿和粪的药物排泄:一般采用小鼠或大鼠，将动物放入代谢笼内，选定一个有效剂量给药后，按一定的时间间隔分段收集尿或粪的全部样品，测定药物浓度。粪样品收集后按一定比例制成匀浆，记录总体积，取部分样品进行药物含量测定。计算药物经此途径排泄的速率及排泄量，直至收集到的样品测定不到药物为止。每个时间点至少有5只动物的试验数据。

应采取给药前尿及粪样，并参考预试验的结果，设计给药后收集样品的时间点，包括药物从尿或粪中开始排泄、排泄高峰及排泄基本结束的全过程。

(2)胆汁排泄:一般用大鼠在麻醉下完成胆管插管引流，待动物清醒且手术完全恢复后给药，并以合适的时间间隔分段收集胆汁(总时长一般不超过3天)，进行药物测定。尽可能同时建立回流通路，确保动物术后保持健康状态。

(3)记录药物自粪、尿、胆汁排出的速度及总排出量(占总给药量的百分比)，提供物质平衡的数据。

5.与血浆蛋白的结合

研究药物与血浆蛋白结合试验可采用多种方法，如平衡透析法、超过滤法、分配平衡法、凝胶过滤法、光谱法等。根据药物的理化性质及试验条件，可选择使用一种方法进行至少3个浓度(包括有效浓度)的血浆蛋白结合试验，每个浓度至少重复试验3次，以了解药物的血浆蛋白结合率是否有浓度依赖性。

一般情况下，只有游离型药物才能通过脂膜向组织扩散，被肾小管滤过或被肝脏代谢，因此药物与蛋白的结合会明显影响药物分布与消除的动力学过程，并降低药物在靶部位的作用强度。建议根据药理毒理研究所采用的动物种属，进行动物与人血浆蛋白结合率比较试验，以预测和解释动物与人在药效和毒性反应方面的相关性。

对高血浆蛋白结合率，且安全范围窄的药物，建议开展体外药物竞争结合试验，即选择临床上有可能合并使用的高蛋白结合率药物，考察其对所研究药物蛋白结合率的影响。

6.生物转化

对于创新性的药物，尚需了解在体内的生物转化情况，包括转化类型、主要转化途径及其可能涉及的代谢酶。对于新的前体药物，除对其代谢途径和主要活性代谢物结构进行研究外，尚应对原型药和活性代谢物进行系统的药代动力学研究。而对主要在体内以代谢消除为主的药物(原型药排泄＜50%)，生物转化研究则可分为两个阶段:临床前可先采用色谱方法或放射性核素标记方法分析和分离可能存在的代谢产物，并用色谱－质谱联用等方法初步推测其结构。如果Ⅱ期临床研究提示其在有效性和安全性方面有开发前景，在申报生产前进一步研究并阐明主要代谢产物的代谢途径、结构及酶催化机制。但当多种迹象提示可能存在有较强活性或毒性的代谢产物时，应尽早开展活性或毒性代谢产物的研究，以确定开展代谢产物动力学试验的必要性。

应考察药效和毒性试验所用的实验动物与人体代谢的差异性，这种差异有两种情况，其一是量的差异，种属间的代谢物是一致的，但各代谢物的量不同或所占的比例不同;其二是质的差异，即种属间的代谢物是不一致的。这时应结合药效和毒性试验的结果来评价这种代谢的种属差异性是否会影响到其药效和毒性。

7.药物代谢酶及转运体研究

药物的有效性及毒性与血药浓度或靶器官浓度密切相关。一定剂量下的血药浓度或靶器官浓度取决于该药物的吸收、分布、代谢及排除过程(ADME)，而转运体和代谢酶是影响药物体内过程的两大生物体系，是药物ADME的核心机制之一。因此，创新药物的研究开发应该重点关注药物主要清除途径的确定、代谢酶和转运体对药物处置相对贡献的描述、基于代谢酶或转运体的药物－药物相互作用的评估等。

体外试验体系是评价药物代谢酶和转运体作用机制的有力手段，应结合体内试验，综合评价药物的处置过程。非临床ADME研究应鉴定药物是否是代谢酶或转运体的底物或抑制剂。体外试验体系如肝微粒体、肝S9、原代肝细胞及P450重组酶等可用于鉴定创新药物是否是P450同工酶的底物并进行代谢种属差异的比较。P450同工酶之外的药物代谢酶，如葡萄糖醛酸结合酶、硫酸转移酶等，也应该在适当的情况下进行评估。药物体外代谢稳定性研究主要通过底物消耗法或代谢物生成法完成。各种不同的细胞体系，如Caco－2，原代肝细胞及单一药物转运体转染的细胞株(MDCK、HEK、CHO)等，是鉴定外排和摄取转运体是否介导药物跨膜转运的有效方法。以外排转运体P－gp为例，若创新药物的外排比≥2，可以初步认为该药物是P－gp的底物。进一步的验证可以通过使用适当的抑制剂完成。确定一种创新药物是否是代谢酶或转运体的底物可以协助判断该药物的动力学特征是否会受到其他药物的影响。

非临床ADME研究应关注创新药物是否通过抑制或诱导代谢酶或转运体影响其他药物的动力学特征。对细胞色素P450同工酶(CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4等)抑制的考察可以通过使用类药性探针底物(Drug－like Probe Substrate)完成。抑制试验应该在酶动力学线性范围进行，即探针底物药物的浓度≤Km(米氏常数)，抑制强弱通过IC50或Ki判断。P450同工酶抑制试验的思路与方法适用于其他药物代谢酶和转运体的研究评价。创新药物对P450酶的诱导应该重点对人CYP3A4以及CYP1A2、CYP2B6进行评估。体外诱导试验可运用人肝细胞多次给药后相关mRNA表达和/或酶活性的变化进行评价。

创新药物非临床ADME研究还应该考虑到药物代谢酶和转运体基因多态性的存在、代谢酶与转运体之间的相互影响、主要代谢物(≥25%原药AUC)的清除机制及潜在的相互作用、人特异性代谢物的评估等。

8.物质平衡

在临床前和临床早期阶段，特别是毒性剂量和有效治疗剂量范围确定的情况下运用放射性标记化合物，可通过收集动物的血浆、粪、尿以及胆汁以研究药物的物质平衡。这些研究能够获得化合物的排泄速率和途径等资料，而且有助于代谢产物的性质鉴定，并可以通过有限的数据比较它们的体内吸收和分布特点。通过体外和动物样品中分离出的代谢产物可用作参比品用于临床和非临床的定量研究。同时，大鼠组织分布研究和动物胆管插管收集的胆汁能够提供药物的组织分布资料和明确胆汁清除特点。一般应采用放射性同位素标记技术研究物质平衡。