基因诊断与基因治疗

重组DNA技术，又称分子克隆或DNA克隆或基因工程技术，是指应用酶学的方法，在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又称载体）连接，形成重组子分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。 在克隆目的基因后，还可针对该基因进行表达产物蛋白质或多肽的制备以及基因结构的定向改造。

1 重组DNA技术中常用的工具酶（2008、2009、2010、2016、2017考点）★★★★

（1）重组DNA技术中常用的工具酶归纳总结（8版生物化学P424）

（续表）

（2）限制性核酸内切酶（RE） 简称限制性内切酶或限制酶，能识别双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸二酯键。 绝大多数RE来自细菌，能限制外源DNA、保护自身DNA，从而稳定细菌遗传性状。 在所有工具酶中，RE具有特别重要的意义。 根据RE的组成、所需因子及裂解DNA方式的不同，可将RE分为三类。

Ⅰ和Ⅲ型RE不在所识别的位点切割DNA（即特异性不强），故在重组DNA技术中应用价值不大。

只有Ⅱ型RE能在DNA双链内部的特异位点识别并切割DNA，对DNA进行精确切割。 因此，重组DNA技术中所说的RE通常特指Ⅱ型RE。

大多数RE的识别序列为回文结构。 回文结构又称反向重复序列，是指在两条核苷酸链中，从5′→3′方向的核苷酸序列是完全一致的。例如某种RE的识别序列，在两条链中，从5′→3′方向均为GAATTC。

多数Ⅱ型RE错位切割双链DNA，产生5′或3′突出末端，称为黏性末端，简称黏端。 另一些Ⅱ型RE对两条链的切割在对应碱基的同一位置进行，产生平头或钝性末端，简称平端或钝端。

有些RE所识别的序列虽不完全相同，但切割DNA双链后，可产生相同的黏端，这样的酶彼此互称同尾酶，所产生的相同黏端称为配伍末端。

有些RE虽然来源不同，但能识别同一序列（切割位点可相同或不同），这样的两种酶互称同裂酶或异源同工酶。

（3）其他常考酶归纳总结（考试重点）

2009 39A.下列选项中不属于重组DNA的工具酶的是

A.拓扑异构酶　B.DNA连接酶

C.逆转录酶　D.限制性核酸内切酶　【答案】ABCDE

2001 146X.重组DNA技术中，常用到的酶是

A.限制性核酸内切酶　B.DNA连接酶

C.DNA解旋酶　D.反转录酶　【答案】ABCDE

2002 30A.在基因工程中，将目的基因与载体DNA拼接的酶是

A.DNA聚合酶Ⅰ　B.DNA聚合酶Ⅲ　C.限制性内切核酸酶

2004 31A.能识别DNA特异序列并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶是

D.DNA连接酶　E.反转录酶　【答案】ABCDE

A.核酸外切酶　B.核酸内切酶　C.限制性核酸外切酶

D.限制性核酸内切酶　E.核酸末端转移酶　【答案】ABCD

2010 38A.下列选项中，符合Ⅱ类限制性内切核酸酶特点的是

A.识别的序列是回文结构　B.没有特异酶解位点

C.同时有连接酶活性　D.可切割细菌体内自身DNA　【答案】ABCDE

1995 140X.从带有遗传信息的m RNA构建成DNA重组体，要利用

A.质粒　B.限制性核酸内切酶

C.DNA连接酶　D.反转录酶　【答案】ABCDE

A.Klenow片段　B.连接酶　C.碱性磷酸酶　D.末端转移酶

2008 127B.常用于合成c DNA第二条链的酶是　【答案】ABCDE

2008 128B.常用于标记双链DNA3′端的酶是　【答案】ABCDE

A.限制性内切酶　B.RNA聚合酶　C.核酶　D.逆转录酶

2016 129B.参与端粒合成的酶是　【答案】ABCDE

2016 130B.具有合成c DNA功能的酶是　【答案】ABCDE

1998 29A.下列哪种酶不参与DNA损伤的切除修复过程

A.核酸内切酶　B.核酸外切酶　C.DNA聚合酶

D.DNA连接酶　E.核酸限制性内切酶　【答案】ABCDE

2017 26A.基因工程中黏性末端连接是指

A.PCR引导肽链与DNA模板连接　B.氨基酸之间肽链形成

C.同一限制酶切位点连接　D.c DNA与RNA形成杂交体　【答案】ABCDE

2 重组DNA技术中常用的载体（2006、2011考点）★★★

载体是为携带目的外源DNA片段，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 载体按功能分为克隆载体和表达载体两大类。 克隆载体用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中的扩增；表达载体则用于外源基因的表达。 有的载体兼具克隆和表达两种功能。

（1）克隆载体 克隆载体应具备的基本特点：①至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩展；②至少有一个选择标志：选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的，如抗生素抗性基因等；③有适宜的RE的单一切点：载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点，可供外源基因插入时选择，这样的序列称多克隆位点。

常用的克隆载体主要有质粒、噬菌体（病毒）DNA等。

①质粒 主要存在于细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的DNA分子，通常为环状双链的超螺旋结构。

②噬菌体DNA 常被用作克隆载体的噬菌体DNA有λ和M13噬菌体DNA。

③其他克隆载体 为增加克隆载体插入外源基因的容量，还设计有柯斯质粒载体（又称黏粒载体）、细菌人工染色体载体和酵母人工染色体载体等。

（2）表达载体 是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体，依据其宿主细胞的不同可分为原核表达载体和真核表达载体。 前者中以大肠杆菌表达载体应用最广泛；后者主要分为酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳类细胞表达载体等。

2011 39A.作为克隆载体的最基本条件是

A.DNA分子量较小　B.环状双链DNA分子

C.有自我复制功能　D.有一定遗传标志　【答案】ABCDE

2006 33A.下列DNA中，一般不用作克隆载体的是

A.质粒DNA　B.大肠杆菌DNA　C.病毒DNA

D.噬菌体DNA　E.酵母人工染色体　【答案】ABCDE

2003 136X.下列关于质粒载体的叙述，正确的是

A.具有自我复制能力　B.有些质粒常携带抗药性基因

C.为小分子环状DNA　D.含有克隆位点　【答案】ABCDE

3 重组DNA技术的基本原理及操作步骤（2009、2010、2012考点）★★★

一个完整的DNA克隆过程包括五大步骤：目的DNA的分离获取（分）、载体的选择与构建（选）、目的DNA与载体连接（接）、重组DNA转入受体细胞（转）和重组体的筛选与鉴定（筛）。

（1）目的DNA的分离获取（分） 分离获取目的DNA的主要方法有：

①化学合成法 即根据某基因的核苷酸序列，利用DNA合成仪通过化学合成直接合成目的DNA。

②基因组DNA文库法 基因组DNA文库以DNA片段的形式贮存着某一生物的全部基因组信息，也包括我们感兴趣的基因。 从基因组文库中筛选目的基因可以通过核酸分子杂交的方法进行。

③c DNA文库法 c DNA文库的构建是以组织细胞中的m RNA为模板，利用逆转录酶合成与m RNA互补的DNA（c DNA），再复制成双链c DNA片段，与质粒或噬菌体载体连接后，转入宿主细胞后可获得克隆群体。 c DNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部m RNA经逆转录而合成的c DNA序列的克隆群体。 从c DNA文库中筛选目的基因也可以通过核酸分子杂交的方法进行。

④PCR法 聚合酶链反应（PCR）是一种高效特异的体外扩增DNA的方法，可将微量目的DNA片段大量扩增。

⑤其他方法利用酵母单杂交系统可克隆DNA结合蛋白的基因，利用酵母双杂交系统可克隆特异性相互作用蛋白质的基因。

（2）载体的选择与构建（选） 载体的选择、构建和改进极富技术性，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。

（3）目的DNA与载体连接（接） 目的DNA与载体的共价连接（DNA体外重组）主要是通过限制性核酸内切酶和DNA连接酶实现的。

（4）重组DNA转入受体细胞（转） 根据重组DNA时所采用的载体性质不同，将重组DNA导入宿主细胞的常用方法分为转化、转染和感染等。

①转化 将重组质粒转化进入大肠杆菌进行扩增是最常用的策略。 将质粒DNA直接导入酵母细胞以及将黏粒DNA导入细菌的过程也称为转化。

②转染 将外源DNA直接导入真核细胞（酵母除外）的过程称为转染。

③感染 以噬菌体载体或黏粒载体构建的重组DNA分子，可通过包装形成病毒颗粒，然后以感染的方式将重组DNA转入受体菌。

（5）重组体的筛选与鉴定（筛） 主要筛选和鉴定方法有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等。

①借助载体上的遗传标志进行筛选 如利用抗生素抗性标志筛选、利用基因的插入失活/插入表达特性筛选、利用标志补救筛选、利用噬菌体的包装特性进行筛选。

②序列特异性筛选 包括限制性核酸内切酶酶切法、PCR法、核酸杂交（分子杂法）、DNA测序法等。

③亲和筛选法 常用的亲和筛选法的原理是基于抗原 抗体反应或配体 受体反应。

（6）克隆基因的表达 经过分、选、接、转、筛五个步骤，便完成了DNA克隆过程，获得了特异序列的基因组DNA或c DNA克隆，这是进行重组DNA技术操作的基本目的之一。 采用重组DNA技术还可进行目的基因的表达，实现生命科学研究、医药或商业目的，这是基因工程的最终目标。

4 重组DNA技术在医学中的应用★★

目前，重组DNA技术已广泛应用于生命科学和医学研究（生物制药、制备人类疾病的动物模型）、疾病的诊断和治疗（基因诊断和基因治疗）、法医学鉴定、物质的修饰与改造等诸多领域。

1992 153X.遗传工程（8版称为“基因工程”）的主要内容包括

A.载体和目的基因的分离　B.限制性内切酶的切割，并把载体和目的基因合成重组

C.DNA重组体的转化表达　D.DNA重组体的扩增、筛选与鉴定　【答案】ABCDE

2012 38A.可以利用逆转录酶作为工具酶的作用是

A.质粒的构建　B.细胞的转染

C.重组体的筛选　D.目的基因的合成　【答案】ABCDE

2009 161X.重组DNA技术中，可用于获取目的基因的方法有

A.化学合成法　B.PCR

C.Westernblotting　D.基因敲除　【答案】ABCDE

2005 136X.在分子克隆中，目的DNA可来自

A.原核细胞基因组DNA　B.真核细胞基因组DNA

C.PCR合成的DNA　D.真核细胞m RNA反转录获得的c DNA　【答案】ABCDE

1994 140X.进行基因工程实验时，常用的技术有

A.分子杂交技术　B.DNA探针技术

C.质粒重组技术　D.基因调控技术　【答案】ABCDE

2010 160X.DNA重组技术中，用来筛选重组体的方法有

A.标志补救　B.分子杂交

C.特异性抗体与产物结合　D.紫外分光光度计分析　【答案】ABCDE

【注意】标志补救是指当载体的标志基因在宿主细胞中表达时，通过互补宿主细胞的相应缺陷（如宿主菌的营养缺陷）而使细胞在相应选择培养基中存活。 B项属于序列特异性筛选，C项属于亲和筛选法。

5 基因诊断和基因治疗（2011、2013考点）★★★

（1）基因诊断的概念 用分子生物学技术对生物体的DNA序列及其产物（如m RNA和蛋白质）进行的定性、定量分析，称为分子诊断。 目前的分子诊断方法主要是针对DNA分子的，涉及功能分析时，还可定量检测RNA（主要是m RNA）和蛋白质等分子。 通常将针对DNA和RNA的分子诊断称为基因诊断。

（2）基因诊断技术 ①基因缺失或插入的诊断：如运用Southern印迹（DNA印迹）或PCR法可判断待测DNA样本是否存在缺失或插入突变；②基因点突变的诊断：方法有等位基因特异性寡核苷酸分子杂交、反向点杂交、变性高效液相色谱、DNA序列分析。

（3）基因诊断的医学应用 目前，基因诊断已被广泛应用于遗传性疾病诊断和风险预测。 其他应用包括多基因常见病的预测性诊断、传染病病原体检测、临床药物疗效评价和用药指导、DNA指纹鉴定（法医学个体识别）。

（4）基因治疗的基本概念 基因治疗是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。

（5）基因治疗的基本策略（重点掌握） 主要分为以下3类：

①缺陷基因精确的原位修复 包括对致病基因的突变碱基进行纠正的基因矫正和用正常基因通过重组原位替换致病基因的基因置换。 这两种方法均属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法，但目前尚未能从理论和技术上得到突破（不易实现，为远期目标）。

②基因增补不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。 这种对基因进行异位替代的方法称为基因添加或称基因增补，是目前临床上使用的主要基因治疗策略。

③基因沉默或失活 有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸，如反义RNA、核酶、干扰小RNA等，可降解相应的m RNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。 这一策略称为基因失活或基因沉默。

（6）基因治疗的基本程序 基因治疗的基本过程分为5个步骤：①选择治疗基因；②选择携带治疗基因的载体，目前用作基因转移载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等；③选择基因治疗的靶细胞；④在细胞和整体水平导入治疗基因；⑤治疗基因表达的检测。

2013 40A.目前基因治疗主要采用的方法是

A.对患者缺陷基因进行重组　B.提高患者的DNA合成能力

C.调整患者DNA修复的酶类　D.将表达目的基因的细胞输入患者体内　【答案】ABCDE

2011 162X.目前基因治疗采用的方法有

A.基因矫正　B.基因置换　C.基因增补　D.基因失活　【答案】ABCDE