果蝇和斑马鱼:

◎Elisa C. Woodhouse，Kathleen Kelly

长期以来，科学家用遗传模型，特别是用小鼠模型，来研究肿瘤转移。其他生物体被用于各种生物过程的遗传分析，例如发育、信号转导和细胞生长。近来，遗传顺从(genetically tractable)的非哺乳动物模型对于肿瘤和转移研究的重要性越来越明显。果蝇(Drosophila melanogaster)就是一个这样的有机体。

自从20世纪70年代就已经知道在果蝇的特定突变品系中会产生肿瘤。科学家已经了解这些肿瘤的分子基础，包括在这些品系具体的肿瘤抑制基因突变，在细胞中产生的缺陷，以及这些异常导致在果蝇中产生肿瘤的方式。用果蝇作为转移模型的最关键优势是能够迅速在体内产生突变并评估其效果。在这一领域，从模型的发现到基于发现的研究均已很成熟。在本章将讨论果蝇模型的几个方面，包括肿瘤抑制基因和人类同源基因、细胞极性在肿瘤发生和发展中的作用、现今应用果蝇理解转移和迁移的方法，以及举例说明通过应用每个模型所获得的知识等。

另一个正在发展更有效的遗传研究的肿瘤模型生物是斑马鱼(Danio rerio)。作为脊椎动物，斑马鱼具有比果蝇更加复杂的生物解剖结构，比无脊椎动物更有利于进一步了解转移潜在机制。斑马鱼以及现有肿瘤模型的应用方法将在本章后面加以讨论。果蝇和斑马鱼的遗传模型可以用于研究转移过程关键步骤中独立的部分，其可在小鼠模型和人类肿瘤上得到验证。

2.2.1 果蝇肿瘤模型

(1) 果蝇肿瘤抑制基因突变表型

已在果蝇中发现了一旦失活即与癌变相关的肿瘤抑制基因。在果蝇中大量的肿瘤抑制基因功能丧失可导致增生性增长，只有小部分肿瘤抑制基因的功能丧失才会导致形成真正肿瘤。这些可致成瘤的肿瘤抑制基因与果蝇的癌及其转移研究才是最相关的。这些基因的突变除了会损伤幼虫的大脑外，还可以引起成虫器的分化和生长受阻，幼虫的囊表皮细胞将会产生特定的成年结构，如眼、腿和触角。这些致瘤形成的肿瘤抑制基因已被广泛的研究，包括lgl (lethal giant larvae)［1］、dlg (discs large)［2］、brat (brain tumor)［3］和scrib(scrib-ble)［4］。这些基因的突变表型非常相似，并且都是在幼虫的后期致死。幼虫发育为过度成长的成虫器，其结构混乱、多层。过度成长的幼虫大脑神经细胞缺乏分化，神经母细胞数量增多。

过去数年的研究显示，这些突变的果蝇肿瘤抑制基因通过破坏细胞极性，从而导致幼虫脑中成瘤。有些肿瘤抑制基因已被证明会扰乱神经母细胞谱系，导致产生具有转移潜能的过度自我更新的神经母细胞和肿瘤(后面将会讨论到)。神经母细胞肿瘤模型系统的基本生物学原理的理解促成了我们现在感兴趣的假说:具有转移能力的、可自我更新的肿瘤细胞与具有自我更新能力的普通干细胞具有相同特性。

(2) 细胞极性与进展中的果蝇肿瘤抑制基因

细胞极性的丧失是肿瘤发生的重要一步。Lgl蛋白和Brat蛋白在保持细胞极性作用和在任何一种蛋白缺失的情况下观察到肿瘤发生方面的研究，已经阐明了控制这一过程的某些分子机制。幼虫神经母细胞通常不对称分裂为两个子细胞，即来源于底端的神经节母细胞(GMC)和一个来源于顶端的较大的神经母细胞。GMC再次分裂，产生了两个终末分化的神经细胞，而自我更新的神经母细胞继续沿袭产生一个GMC和一个神经母细胞(图2-3)。在果蝇的神经母细胞中，不对称分裂是通过将细胞顶部和底部组分分裂为各自的皮层区域来维持。神经母细胞系依赖于GMC中神经母细胞基因表达下调，以及隔离GMC神经决定子。Lgl被发现与PAR复合物的相互作用(Bazooka/Par-6/aPKC，in Drosophila)，用于调节顶部/底部细胞极性［5，6］。Lgl和PAR复合蛋白a PKC的控制是通过其相互抑制作用实现的。定位于顶部的Lgl被a PKC磷酸化，因构象变化导致其被释放［7］，限制了激活的Lgl到达神经母细胞的底部［5］。激活的Lgl蛋白在底部区域可抑制a PKC的活性。基因数据表明，Lgl调节a PKC，而a PKC通过控制神经细胞的特定基因和神经元细胞命运决定子，从而直接促进神经细胞的自我更新［8］。促进神经细胞命运的蛋白质定位在底部。Miranda蛋白［9，10］和它的装载蛋白、转录因子Prospero［11，13］是定位于基底神经细胞决定子的关键因子。Brat蛋白通过与Miranda蛋白联合作为荷重蛋白而定向底部［14］。Prospero蛋白定位在底部需要Brat，可能是通过稳定Miranda蛋白和Prospero蛋白相互作用实现的。在缺乏Brat蛋白功能的突变体中，底部子细胞表达Miranda蛋白，但不表达Brat和Prospero蛋白。brat突变的GMC子细胞保持表达一些神经母细胞特定蛋白，并且高频率地转变成为神经母细胞(图2-3)［14］，使异常细胞的自我更新以分化为代价，这会导致出现与lgl突变体中相似的表型。其他细胞极性决定子的突变体也可导致果蝇侵袭性肿瘤的发生。幼虫Wain组织中存在pins、miranda、numb或prospero(pros)基因突变，在移植中会在远端位点形成继发肿瘤(即转移)［15］。

图2-3 Brat可阻碍神经母细胞的自我更新并促进GMC的分化

注: 上图所示:野生型神经母细胞分隔 Miranda、Brat 和Prospero(Pros)成为GMC。在GMCS中，Miranda分解，Brat在胞质中，Pros在细胞核中，神经母细胞基因下调。GMCs有丝分裂为两个神经元。下图所示:在brat突变体底部，神经母细胞分隔Miranda而不分隔Brat和Pros成为GMC。GMC保持神经母细胞基因表达并表现出延迟分化，有一些最终成为神经元，还有一些似乎扩大为增殖的神经母细胞。图中显示brat突变体有异常神经母细胞。单脑叶或brat11/brat1196小时后，在固定前幼虫侧剖面用神经母细胞标记Miranda(Mira) 、Deadpan(Dpn)和神经元标记Elav染色并进行4小时BrdU脉冲，评估增殖情况。带尾箭头标注的是神经母细胞;三角箭头标注的是GMC［14］。

(3) 果蝇肿瘤抑制基因的人类同源基因与致癌作用

已证明在人类肿瘤发展过程中也会发生顶部-底部决定子的分隔。人类同源a PKC和Lgl、a PKCζ和Hugl-1已被证明与多种上皮癌有关［16］，Hugl-1表达水平的下调与大肠癌、黑色素瘤的形成和发展有关［17］。Hugl-1缺失与内皮细胞癌的淋巴结转移和预后差也有关［18］。这些蛋白的适当定位也似乎是抑制肿瘤发生的关键。在卵巢肿瘤的黏液和浆液中已发现错误定位的aPKCζ和Hug-1蛋白。在黏液和浆液性癌中，aPKCζ和Hugl-1在细胞质中，而aPKCζ的顶部特异性则消失。在卵巢癌［19］和肺癌［20］中也发现aPKCζ表达上调。其他两个人类同源果蝇肿瘤抑制基因discslarge和scribble与结肠癌发展有关。hDlg和h Scrib两种蛋白表达水平的下降，与细胞极性和组织构造的损伤有关。以往研究这些蛋白与人类癌症的关联显示，Dlig和Scribble蛋白以降解HPVE6为目标［21，22］。最近一项研究比较全部基因在多种肿瘤细胞系和非致瘤亲本细胞系中表达，发现一种已知的在哺乳动物中可以调控果蝇细胞极性的蛋白，即Crumbs，其在肿瘤细胞株中显著下调。当小鼠肾脏上皮细胞中crumbs3基因表达被抑制后，顶部-底部极性和接触性抑制生长会被打乱。基因表达的修复可抑制这些作用，并且抑制肿瘤细胞株的迁移和转移［23］。两者证据表明，在果蝇中控制两极化、维持组织的完整性和构架，以及抑制转移的机制在哺乳动物肿瘤中是保守的，如果控制这些过程可能有助于人类癌症的治疗。

(4) 果蝇肿瘤的转移

已创建可视并在继发位点操纵肿瘤生长的果蝇模型，以便更好地了解肿瘤转移过程中重要分子的基本原理。以原发瘤转移到远处的肿瘤生长作为参考，用以分析侵袭、转移和定位的特性(图2-4)。本质上讲，存在两种使用果蝇肿瘤抑制基因的转移模型:一种方法涉及将肿瘤抑制基因突变体的组织移植到野生型组织，第二种办法是原位观察转移。

(5) 移植转移模型

移植转移模型在初步研究中的应用，鉴定了lethal giant larvae基因是肿瘤抑制基因突变体［25］。随后对方法进行了修改，引入了肿瘤细胞标记物β-半乳糖苷酶，使肿瘤细胞生长和转移可以定量。该方法的基本操作和原理为:把从突变幼虫分离的供体组织腹部注射到野生型成体蝇宿主，培养一段时间，其间肿瘤生长并经历了转移。成体宿主用β-半乳糖苷酶活性染色，在远离注射点处确认肿瘤源性细胞(图2-4)。

利用这种方法发现，大多数的lgl(87%)和brat(84%)脑组织碎片和比例可观的dlg(22%)脑组织碎片发生了转移，还有lgl(43%) 和dlg(53%)的成虫盘肿瘤也发生了转移。移植后的肿瘤生长动力学分析表明，源于一小群细胞的肿瘤仅代表1%～2%的移植肿瘤组织细胞。

使用将标记的果蝇肿瘤组织注射到成体宿主的移植方法，可以用于确定组织转移需要的基因［26］。使用随机元素P诱变，分离出破坏了lgl细胞转移的特定突变，同时发现了受影响的基因。研究发现，lgl细胞的肿瘤形成和转移需要semaphorin5c基因。Semaphorin5c基因是Semaphorin家族成员，是重要的轴突导向分子［27］。另外一个突变apontic基因特别影响转移。apontic基因已被证明作为一个转录因子，是胚胎发育迁移中所必需的［28］。第三个突变激活了pointed基因，一个Ets域转录因子，是导管细胞迁移及其他方面发展所必需的［29］。与野生型相比，缩短了注射这些肿瘤细胞宿主的生存时间。

图2-4 来源于致死巨人症幼体、脑瘤和discslarge移植产生的继发肿瘤，携带miranda基因突变体克隆的脑碎片或突变体脑碎片

注: (A) 脑瘤、头部或胸部继发肿瘤，全标本包埋。(B)discs large、卵巢继发肿瘤(箭头)，全标本包埋。(C)discs large、腿部继发肿瘤(箭头)，全标本包埋。(D)致死巨人症幼体、头部继发肿瘤(箭头)，部分标本。(E)致死巨人症幼体，腔内肿瘤(箭头)，部分标本。(F)discslarge、胸部继发肿瘤，部分标本(A～C的比例尺为100nm，D～F的为50nm)。(G)标记GFP及mirazz17的幼脑碎片，在植入两周后体积增长了数倍，一大团植入组织(绿色)在宿主中，一个较小的定植肿瘤(黄色箭头)分布在距离初始植入位点(黑色箭头)较远的位置［24，15］。

由于果蝇宿主有一个开放性循环系统，细胞有可能在不跨越组织障碍的情况下从注射部位迁移，因此，接受肿瘤组织移植的宿主可能具有被动和主动迁移细胞的混合。因此，对移植转移分析作了进一步修改，以观察宿主卵巢管中的微转移来专门研究具有侵袭行为的细胞(图2-5)［30］。这种方法可以用来显示来源于lgl和brat组织有不同特性的转移瘤。例如，卵巢管被lgl肿瘤细胞入侵的频率随着体内培养时间上升，然而来源于brat肿瘤的微转移则不会如此。此外，在神经细胞标记表达中，研究者发现，来源于lgl和brat肿瘤的转移细胞是不同的，来源于lgl组织的转移细胞共表达神经元和神经胶质细胞标记，而大多数brat转移细胞不表达其中任何一个。这表明，虽然Lgl和Brat蛋白都是通过将神经母细胞分裂的平衡状态转变为过度自我更新，从而打乱神经细胞分裂，但转移瘤的分子特性却不同。移植实验的另外一个改进［15］，是将肿瘤细胞用绿色荧光蛋白(GFP)标记，以区分成体宿主中的肿瘤细胞(图2-4G)。正如前面所示，极性决定因素Pin和Miranda的突变会导致肿瘤发生。这些肿瘤转移，通过注射位点的远端荧光定位，肿瘤可以在活体内可视化，并重新获得活的GFP阳性细胞。最重要的是，不经染色可以将生物分子从肿瘤细胞中分离出来，而不至于损害其完整性。

图2-5 果蝇脑瘤细胞在宿主卵巢管中形成微转移。通过对包含brat(A)或lgl(B)基因突变体微转移(绿色箭头)的宿主卵巢管做共聚焦截面，显示微转移已穿过上皮鞘肌肉层(红色)［30］

(6) 原位肿瘤转移模型

另外一个在果蝇中模拟转移的方法是检查肿瘤细胞的原位(机体内部)转移。与移植模型相反，从有机体中分离出一块肿瘤组织，其中所有细胞的肿瘤抑制基因失活。这种原位方法需要在其他正常组织中产生缺乏特定肿瘤抑制基因的细胞标记克隆。这些细胞在特定条件下在有机体内转移。肿瘤模型中的细胞克隆模仿了人类癌症，其肿瘤细胞与正常细胞相邻，接受正常细胞环境的信号。当肿瘤抑制基因scribble的突变体克隆生长在幼虫的眼成虫器上，则突变体克隆不会过度生长［31］。这与scribble突变体幼虫相反，scribble突变体幼虫显现肿瘤的成虫盘大脑［4］。然而，当与致癌基因ras和notch突变结合时，scrib克隆确实生长了［31］。这种研究原位克隆肿瘤的方法可用于鉴别促进非侵袭性细胞团成为可以远处播散肿瘤的基因。一项研究［32］使用了这个方法，发现scrib基因的突变以及肿瘤抑制基因lgl和dlg的突变，可导致Rasv12肿瘤的发展(图2-6)。这些突变可以导致大的原发瘤并向远处转移，远处转移可以通过GFP标记突变体克隆实现可视化。在这个系统中，肿瘤抑制基因不能引起转移肿瘤克隆，可能是由于scrib-克隆周围存在正常细胞(图2-6)。

一个重要的问题是，维持细胞极性和形态所必需的其他基因突变是否也会促进肿瘤生长。bazooka、stardust和cdc42的突变确实会促进Rasv12肿瘤的发展。这种检测果蝇肿瘤细胞转移的方法已被其他研究采用。另外一个小组［33］发现，Rasv12突变细胞Src水平高表达，导致转移性生长。作者提出在人类肿瘤中Src水平的高表达可能也与原癌基因ras发展结合而促进转移。

(7) 边界细胞的迁移:在果蝇中模拟肿瘤细胞迁移

转移性肿瘤细胞的一个标志性特征是运动能力的增加。一个研究细胞迁徙行为的成熟果蝇模型是卵室边界细胞模型。发育中卵室的关键形态发生事件是一群上皮细胞进行特征性的迁移，这种细胞叫做边界细胞。在发育过程的特定点，一种叫做极细胞的特殊卵泡细胞，从前上皮毛囊细胞招募4～8个细胞形成一个边界细胞群，侵入营养细胞复合体并迁移到前卵母细胞［34，35］。应用基因筛选发现了控制这一调节过程的分子，并已鉴别出很多需要边界细胞迁移的通路，包括PDGF/VEGF、EGF、JAK/STAT、Notch和JNK信号通路［34］。一个蛋白即Slbo，被发现是边界细胞迁移的关键调节因子，它是一个与C/EBP同源的基本区域/亮氨酸拉链转录因子［36］。边界细胞全基因芯片分析是基因方法的补充，并证明了控制迁移行为的复杂性［37，38］。分析迁移基因的两种芯片，鉴定出几百个基因(300～400)，与卵泡中非迁移细胞相比，这些基因在迁移细胞中表达上调。来源于slbo突变体的边界细胞有大约150个基因，与野生型边界细胞相比其表达水平较低。在迁移细胞的这些基因中，大约富含100个重叠基因。对迁移重要的基因中富有细胞骨架调节因子及分泌与内吞途径中的因子。

图2-6 具有表达GFP的mosaic克隆(上图)和从第三龄幼虫分离cephalic复合体的果蝇中肿瘤进展的模型(下图)

注: 在所有图中，上方为顶部，口钩(A中的箭头)在顶部，腹神经索(A中的箭头)指向下方。转移肿瘤细胞导致幼虫期延长，最后细胞侵入VNC，以巨型幼虫的状态死亡(E中的箭头)［32］。

边缘细胞迁移模型用于研究在迁移细胞中Awd的功能，Awd是果蝇的同源转移抑制基因nm23。科学家在20多年前就确认了，nm23在高转移性黑色素瘤细胞系中作为c DNA被下调［39，40］，因而当其在转移细胞系中表达时可以抑制转移和转移细胞的运动性［39］。然而细胞功能例如核酸二磷酸激酶［41］和组胺素依赖的蛋白激酶［42］的活性已分配给nm23。nm23在细胞转移方面的功能一直是被研究的对象［41］。虽然在边界细胞迁移开始前Awd以高水平表达，但从上皮细胞分离前其表达量明显下降，且在边界细胞迁移时保持低水平［35］。Awd的重新表达，特别是在边界细胞中的重新表达，阻碍了边界细胞迁移(但没有边界细胞群的形成)，同时缓解了组成性激活Pvr的迁移抑制表型。Awd的活性使Pvr降低到控制水平而修复迁移缺陷。同时发现， Awd也是表面受体Domelss的负调节因子，而这需要STAT的核移位。实验研究Awd和Domeless或Pvt的关系得出， Awd通过干扰dynamin依赖性内吞作用，控制细胞迁移重要表面受体的表达，这通常需要精确的时间和空间迁移控制。nm23可能在通过控制很多细胞表面的内吞受体而调节肿瘤细胞活性方面发挥相似的作用。支持这一假说的是，发现溶血磷脂酸受体EDG2在nm23-H1突变的乳腺癌转移细胞中高表达。

(8) 果蝇瘤形成的肿瘤生物学

从果蝇肿瘤形成的肿瘤模型中得出的结论与在哺乳动物肿瘤的信号转导通路和功能的许多关键概念是一致的。许多哺乳动物肿瘤转移相关分子也在果蝇肿瘤中发挥了作用，确认了果蝇作为肿瘤模型可以提供人类肿瘤生物学的见解，可能包括人类转移性肿瘤的治疗干预。果蝇肿瘤的实验证明这些细胞的转移是一个活动过程，不只是简单的细胞从一个区域被动移动到另外一个区域停靠的运动。此外，在人类转移性细胞中，细胞的转移行为与特定蛋白的表达有关，否则会阻碍转移。例如，果蝇Rasv12/scrib-/-肿瘤能够从原位迁移到发育中的眼并入侵腹神经节［32］。共聚焦显微镜显示这些入侵细胞的前缘表达高水平F肌动蛋白，这在主动迁移细胞中是很常见的。此外，这些细胞定位在腹神经节内，说明侵袭确实发生了。检验Rasv12/scrib-/-肿瘤基膜的完整性实验表明，突变体眼磨片周围基膜的很多位置被破坏，表明基膜被突变细胞降解。进一步的研究证明在果蝇肿瘤转移之前需要基膜的重塑。一项研究发现，果蝇基质金属蛋白酶在Rasv12/scrib-/-肿瘤中上调，并且可促进这些细胞的侵袭行为［43］。部分抑制侵袭表型在mmp-1突变体中由Rasv12/scrib-/-克隆获得。组织抑制金属蛋白酶(TIMP)和另外一种回复引导半胱氨酸丰富及含kazal基因的蛋白酶抑制剂(RECK)的表达，并可完全阻碍侵袭［43］。另一项［44］利用果蝇卵巢管侵袭模型研究表明，MMP-1可促进lgl的转移，但对brat肿瘤无影响。MMP-1在lgl肿瘤中的表达量上调;除去MMP-1，则可降低lgl肿瘤细胞卵巢管微转移的概率。突变脑组织移植入brat(但不是lgl)的宿主，MMP-1在宿主卵巢中上调。虽然MMP-1表达的调控不同，但依赖于原发瘤的突变，MMP-1的表达成为卵巢管侵袭所需要的重要组分。在lgl和brat肿瘤中，TIMP的表达可使转移概率降低。比较在lgl和brat肿瘤中MMP-1表达调控的差异，为进一步探索发生在特定肿瘤抑制基因突变体下游的分子事件提供机会。

2.2.2 斑马鱼肿瘤模型

利用斑马鱼(zebrafish)来模拟肿瘤是一个越来越普及的方法，并预计其将在3个领域发挥效用。首先，这种模型的遗传筛选能力可以帮助鉴别对肿瘤转移过程起作用的遗传修饰。第二，斑马鱼的荧光成像性能特别有助于实现肿瘤进展和微环境相互作用的可视化。第三，斑马鱼药理检测依从性提供了筛查肿瘤化学修饰的平台。在斑马鱼中应用遗传询问的主要方法和现存的肿瘤模型例子将会在这个章节中简要讨论。我们已经介绍了关于如何开发应用荧光成像技术更有效地监测肿瘤转移过程的情况，包括肿瘤细胞播散及肿瘤与脉管系统的相互作用，以及有关应用斑马鱼研究肿瘤转移的优势和需要发展的领域。

(1) 斑马鱼基因学

斑马鱼很容易进行基因操作［45、46］。另外一些使斑马鱼成为有吸引力模型系统的因素有体外授精、高繁殖力、快速生长和高放养密度。斑马鱼的胚胎和幼虫是透明的，这对于直接评估和挑选发育明显的表型有很大帮助。此外，斑马鱼存在相当可观的基因组资源，包括斑马鱼完整的基因组序列，这可以很好地帮助鉴定突变(见http://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish)。化学诱变和向前表型驱动筛选或逆转等候选基因方法，可以使鱼的突变品系具有实用性，其中一些与哺乳动物肿瘤生物学有着明显的相关性。

使用反转录病毒整合的方法使随机诱变成功地应用于斑马鱼中。正向基因筛查已应用到可筛查表型如增殖缺陷或胚胎致死性中，随后可以观察特定肿瘤发生率提高的成年表型。用这种正向表型筛查出的多数基因与哺乳动物的癌症无相关性，如Myosin、Separase多个核糖体蛋白，它们与人类肿瘤的关联还有待确定。

因为在斑马鱼中存在原始全基因组的重复现象， W-ethyl-N-亚硝基脲诱变后，可用反向筛选方法直接筛选已知或预期的肿瘤相关基因。因此在某些情况下，基因重复可能导致产生亚功能和新功能，就像已经发现的pten重复同源体ptena和ptenb［47］。采用反向基因方法已在人类肿瘤中证实的肿瘤相关基因的突变系，如tp53、ape、ptenb，以及显示特定自发或致癌物诱发癌症的高发率错配修复基因［47-49］。在这些品系中自发产生肿瘤的概率为3%，这些肿瘤发生于7～18个月。这些自发肿瘤类型往往与人类不同，例如神经鞘瘤。另一方面也阐述了肝脏和肠道肿瘤及肉瘤。

在斑马鱼中应用转基因技术，模拟了几种人类常见肿瘤类型［45，50-52］。转座子介导的转基因技术可以通过将结构注射入受精卵中完成，产生概率＞5%的生殖系传递。斑马鱼转基因肿瘤模型是根据我们已所熟悉的原理建立的，即组织特异性启动子操纵癌基因表达。通常，荧光标记与癌基因共表达，使表达癌基因的细胞直接可视化。虽然每个肿瘤模型都需要进行分别的评估，但有证据表明，某些人类和斑马鱼的肿瘤类型在组织学和分子学上都有相似之处［53，54］。如今，模型已经越来越成熟，利用Cre-loxP技术联合条件性表达［55］在处理小鼠模型的基因组中被广泛应用。

已经利用在淋巴细胞中高表达rag-2启动子，发展出几种白血病模型［51，56］。另外，组织特异性可以由原癌基因决定，像白血病融合蛋白TEL-AML1，其表达自普遍存在的β-actin启动子，导致B超谱系白血病［57］。此外，在未分化的肌肉中rag-2驱使k RASG12D表达的情况下，构建启动子的意外异常表达被用来开发模型，产生横纹肌肉瘤［54］。实体肿瘤模型已经可产生横纹肌肉瘤、黑色素瘤和神经内分泌肿瘤［54，58，59］。随着越来越多的组织特异性启动子被研究，肿瘤组织学类型的范围有望扩大。肿瘤形成模型的外显率是多变的，说明其他基因活动参与了肿瘤的形成［45，50］。与此一致的是，跨两个转基因模型或跨一个转基因模型和一个突变肿瘤敏感系，可导致肿瘤发生率的提高，以及提高肿瘤的侵袭性或缩短肿瘤潜伏期。

(2) 斑马鱼肿瘤的荧光成像

斑马鱼在一个完整的脊椎动物系统体内单细胞水平的荧光细胞成像能力非常明显［52］。如前所述，斑马鱼的胚胎是透明的，而成年斑马鱼则不是。尽管正常的皮肤和皮下组织能使空间分辨率受限，然而成年斑马鱼足够小，允许活体内荧光器官或肿瘤的可视化。透明成年斑马鱼(roy-/-、nacre-/-)最近的研究进展，即所谓casper变异，可提高观察的敏感性，解决并量化荧光细胞［60］。

荧光成像被用于转基因模型和移植的研究中。在转基因模型中，原癌基因表达的荧光标记使正在发展的肿瘤可视化，包括发病时间、地点和增长率。重要的是，荧光标记肿瘤细胞也可提供一种分析肿瘤对治疗反应的手段［61］。荧光也可用于跟踪控制Cre-lox P介导的重组事件，其可识别异源混合物中的转基因细胞。由明显分化依赖性启动子驱动的荧光标记已被用于鉴定肿瘤的细胞分化［54］。在肿瘤微环境中荧光标记的表达如血管，可制作宿主-肿瘤相互作用图像［62］。

荧光标记细胞的移植实验已被用于观察定位和与宿主脉管系统的相互作用。成年或未成年的宿主鱼一般在移植前被免疫抑制。细胞可以通过心脏路径进入，或进行细胞群腹腔注射。虽然来源于斑马鱼肿瘤的细胞系还没有建立，但有可能以原发肿瘤单细胞悬液移植，并观察远离移植肿瘤位置的一小群细胞的播散［60］。另外，人类肿瘤细胞系的异种移植已经完成。在一项研究中，多色高分辨率共聚焦显微镜使科学家观察到了基因操作的人类肿瘤细胞和斑马鱼脉管系统间的动态交互，并可血管重塑［63］。令人惊讶的是，不论内在发展还是移植，荧光标记的肿瘤细胞与荧光宿主器官结合，提供了在适当机体环境中实时无创观察肿瘤细胞的手段。

(3) 斑马鱼作为转移的遗传模型

对于未来研究的一个令人兴奋的可能性是，加深对斑马鱼成瘤模型的研究，即研究转移机制(图2-7显示从斑马鱼移植位点转移的肿瘤细胞)。斑马鱼系统研究潜在转移的分子事件的两个优势是:异常顺从性和相对简单以及高效的体内药物分析。斑马鱼可以直接从水里吸收小分子化合物，这种有机体特别适合在活的脊椎动物中开展药物筛选。用斑马鱼开展高、中通量筛选来说明转移机制的作用还需要进一步确定。

图2-7 移植黑色素瘤细胞在casper突变体斑马鱼中从移植位点远端迁移。单一迁移的黑色素瘤细胞(右图标记)从移植位点迁移到背部皮肤［59］

不管是转移相关表型的遗传筛选还是药理筛选，都依赖于高效率生成和容易取得的系统，例如转基因荧光肿瘤模型。由于可以自动和定量产生体内肿瘤细胞特征的清晰视觉效果图，将有利于这一重要领域研究的发展。有关发现新基因或新通路的潜在意义的一个可能方案是对肿瘤细胞播散的进展或抑制的筛查。然而，一个关键的问题涉及各种转基因模型肿瘤发展的自然史，如在远端存在肿瘤克隆，是否来自于血管扩散或淋巴扩散;如果没有血管内渗，在组织中具侵袭运动性的肿瘤细胞也是有可能的。在得知这种模型研究哺乳动物癌症进展相关机制的实用范围之前，还是需要斑马鱼肿瘤模型其他基本特征研究的协助。

另外，筛选基因或化学修饰基因可以不考虑在斑马鱼中的进展表型，例如已知的促进哺乳动物癌症发展和转移的基因ras。在这种情况下，筛选可以分析例如肿瘤细胞生存或新陈代谢的效果。斑马鱼肿瘤模型的发展显示应用这些系统研究癌症发展的潜能，并可能确定用于转移治疗相关的先导药物。虽然有许多方面还没有弄清楚和开发，但斑马鱼模型已经开始并有可能继续在肿瘤生物学研究中占据独特和重要的地位。

2.2.3 结论

当各种生物和动物模型被用于研究人类肿瘤和转移时，必须考虑模型系统和人类生物学之间生理特性的显著区别。然而，本质上保守的信号通路及其功能效应使基因顺从模型作为临床标本、哺乳动物模型和细胞系的有价值补充。尽管与人类相比，果蝇和斑马鱼的肿瘤有所不同，但是这些模型提供了独特的正向和逆向遗传筛选的机会，可以筛选影响肿瘤形成和(或)转移的基因，并且完成了在其他模型中很难或不可能的操作。在无偏差遗传筛选中发现，相同信号通路或交叉调节其他信号通路的蛋白质间存在密切关系。最近，成像技术的进步，使成熟的遗传技术与体内癌症和转移相关生理过程的动态监测成为可能，这些有用的模型系统，在未来作为强大的研究手段将会产生更多的创新。

(乔鹏译，钦伦秀审校)

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