活体显微镜显示肿瘤侵袭转移

◎Cristina Hidalgo-Carcedo，Erik Sahai

肿瘤转移是个复杂的过程，包括细胞获得运动能力、内渗到血管和淋巴管、在脉管系统内存活以及外渗并在新组织中增殖［1］。然而，一些因素阻碍了肿瘤转移研究。在多数研究中，通过在固定的材料中出现明显转移灶来评估肿瘤转移。尽管对于整个过程来说这是个可靠的方法，但却难以提供更多有关肿瘤转移过程中不同步骤的信息。另外，肿瘤转移经常发生在不易接近的解剖部位，这使得观察转移过程的不同步骤变得困难。而且原发瘤中仅有少部分细胞会形成转移，这进一步增加观察转移过程的难度。一个典型的转移性原发瘤中包含数以百万计的细胞，却产生很少数量的转移灶。因此，寻找确实参与转移过程的少量细胞并不容易。克服这些问题的方法是:对含有转移性癌细胞的活体组织进行高分辨率光学成像。这种技术被称为活体成像［2，3］。

该章将会描述活体成像怎样促进我们对于转移的理解。首先介绍应用于显示肿瘤内相关信息的活体成像技术，随后讨论这些技术促进对于转移过程理解的方式。

2.4.1 活体成像方法

活体成像明显依赖于肿瘤的形成过程、捕捉图像的设备以及肿瘤组分的标记方法。

(1) 肿瘤的形成

注射肿瘤细胞:用于成像所需的肿瘤，最常用的方法是将肿瘤细胞系注射入实验动物(通常是小鼠)，产生异种移植肿瘤。通常，肿瘤细胞注射于小鼠皮下数周内就能形成肉眼可见的肿瘤。这种方法方便，但在表皮下生长的肿瘤细胞通常不是最合适的解剖位点。免疫功能不全小鼠的应用为人类癌细胞株的增殖提供了可能，但同时也存在缺陷，即免疫系统的作用不能在肿瘤转移中得到充分研究。另外，技术上比较困难的模型是将肿瘤细胞原位注射到相应解剖位点。例如，将乳腺癌细胞注射到乳腺脂肪垫中［4］，或将神经胶质瘤细胞注射到大脑组织［5］。另外，还可将肿瘤细胞直接注入血液，并能追踪到它们在循环中播散和退出。

所有这些方法都可使肿瘤细胞在注射前被标记，以便于后续的检测。为了有助于长时间重复多次高分辨率肿瘤成像，可在覆盖于肿瘤的皮肤里植入一个“视窗”［6，7］。这就避免了额外的外科操作去暴露肿瘤。然而，需要更加密集的观察，并且担心肿瘤生长在玻璃等人工基质上的有效性。

转基因和化学诱癌模型:注射肿瘤细胞的主要缺陷是无法描述早期肿瘤的发生和从原位到侵袭性癌的进展过程。肿瘤的进展可以用化学致癌物促使肿瘤形成来模拟［8］。另一方面，转基因技术可以产生兼备致癌基因和肿瘤抑制基因功能丢失的细胞，并生成肿瘤［9］。后者可以提供非常强大的人类肿瘤小鼠模型。然而，这是个耗财耗力的过程，还需要额外的遗传操作来标记肿瘤细胞。

(2) 成像设备

全身荧光:这种方法包括整个动物的无创性成像［10］。物体被某一波长的光照射，而发射波长更长的荧光才可被检测到。目前这种方法的分辨率被限制在1mm左右，而且存在深处组织可靠成像的问题。然而，设备在不断地改进，从不同角度给同一动物成像或利用复杂的光源等方式，能够使层析成像重建以及在三维空间拥有更高的分辨率［11］。毛发给这种类型的成像带来了巨大挑战，因为它不仅散光而且自身发光。为了克服这个问题，通常使用剃过毛发或者无毛的动物。

全身生物发光:该项技术类似于荧光，而区别在于它依赖生化反应而不是荧光发光。向体内注射入适当的底物进行生物发光，可检测动物体内表达荧光素酶基因的细胞(参考“标记肿瘤组分”部分)。该种方法的灵敏度和分辨率大体上与全身荧光法相似。

落摄荧光显微技术:这项技术与全身成像采用同样的荧光原理。因为采用了光学显微镜，因而分辨率大大提高［2，10］。改进后的分辨率使深度成像成本降低。事实上，通常也需要通过外科手术暴露需要成像的区域。尽管使用外科手术植入的视窗能克服这个问题，但是限制了同一动物重复成像的范围。

共聚焦显微镜:共聚焦显微镜(有时也被称为激光扫描显微镜)最主要的优势是可获得优越的三维信息［2］。落摄荧光显微技术能从聚焦平面外捕获大量光，而共聚焦显微镜不能。这实际上意味着组织能用纯光学手段进行区域划分。许多共聚焦显微镜的衍生技术用于活体成像。其中两种最常用的有:一个是多光子共轭焦显微镜［12］，它能用较长波长的光去提高成像深度;另一个是旋转的非共聚焦，它能快速成像［13］。

(3) 标记肿瘤组分

癌细胞可视化:为了使肿瘤细胞成像，需要标记肿瘤细胞，以区别于其他细胞。一般通过染色或荧光染色进行标记［14］。然而，这些方法也有缺点，会随着细胞的每次分裂标记的染料被稀释，因此在长期实验的过程中不断降低其适用性。另外，染料仅能用于标记将要注射的肿瘤细胞，而并不适用于更复杂的转基因模型。肿瘤细胞也能设计表达编码来自于水母或者珊瑚的荧光蛋白基因［10，15］。最常用的蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)。GFP表达肿瘤细胞的例子如图2-14所示。这种方法的遗传特性提示肿瘤细胞可以长期稳定标记和跟踪。不同细胞类型可以由不同的荧光蛋白标记，这样就能明确分辨并研究它们的相互作用，或对它们的行为进行比较［16］。在转基因模型中也可使用荧光蛋白［17］。可见，荧光蛋白是多数研究用于标记肿瘤细胞的方法。

一种叫做荧光素酶的编码生物性发光酶基因也被用于标记肿瘤细胞［18］。利用表达荧光或生物发光蛋白的主要缺陷是其在临床发展的空间很小，目前用这种方法在癌症患者身上标记肿瘤是不大可能的。为了解决这个问题，一些研究小组已经在研究抗“癌症抗原”的抗体荧光标记［11］，或者开发如蛋白酶等针对肿瘤特异活动的其他探针［19］。

非肿瘤细胞可视化:在多数情况下，非肿瘤细胞来自于那些已经注射肿瘤细胞的宿主动物，这样可以避免在体外作标记。转基因技术可以实现宿主动物所有细胞或部分细胞表达荧光蛋白［20～22］。如果将宿主细胞和肿瘤细胞用不同颜色的荧光标记，就能明确分辨不同的细胞群体。但需要再次强调的是转基因操作是极耗精力的。一些非肿瘤细胞通过注射可以被与其相互作用的荧光染料所标记。例如，具有吞噬作用的巨噬细胞能通过吞噬荧光标记的葡聚糖而被检测(图2-14)。反射成像能够显示细胞内密集泡的存在，某些情况下还能显现整个细胞形状。

血管可视化:如果大部分肿瘤由荧光细胞组成，可通过没有荧光的黑暗结构识别血管(图2-14)，或者通过在静脉环流中注入荧光染料而被辨认(图2-15)。

细胞外基质可视化:细胞外基质为大多数组织提供了物理支持，也是肿瘤细胞运动的屏障。反射(reflectance)成像能提供纤维基质结构的信息，如果用基于倍频效应的近红外线照亮(发出光的波长是照明光的一半)成像则可更加特异地显示胶原纤维［12］(图2-14)。这些技术能够更详细地研究肿瘤细胞与细胞基质间的相互作用。

蛋白质动力学可视化:除了观察细胞及其周围基质外，特定蛋白的位置和动力学也能被可视化［23，24］。通常是通过将兴趣蛋白的编码基因与荧光蛋白编码基因融合完成的，然后这个荧光融合蛋白在肿瘤细胞中稳定表达。图2-16为被肌球蛋白轻链(MLC)融合的GFP稳定转染的乳腺癌细胞。MLC能清晰地定位于体内分裂细胞的分裂沟里(图2-16，用星号标记)。不同颜色的荧光蛋白能够同时在细胞中表达，确保可以同时研究多种蛋白的位置。而且，当两个不同颜色的荧光细胞极为贴近时，能发生能量转移，这个过程被称为荧光共振能。它能提供两个荧光细胞融合时相互作用的信息［25］。

图2-14 肿瘤微环境的活体成像

注: 这些图是应用多光子共聚焦显微镜进行小鼠乳腺肿瘤活体成像。乳腺癌细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)膜标记(图i，ii，iii，vi和vii的绿色)。注射入TRITC-葡聚糖(图i，ii，iii，vi和vii的红色)可以标记宿主的巨噬细胞。白色的反射成像(图i，ii和iv的白色)显示了多种结构，包括胶原蛋白纤维、血管和脂肪滴。蓝色为胶原纤维在肿瘤两个区域中的二次谐波成像(图iii所示);图vi显示具有明确膜标记定位于细胞-细胞间接触的有序细胞区域;图vii显示一个更混乱和更少上皮排列的肿瘤细胞区域;图viii是图i的示意图(比例尺:50μm)。

图2-15 肿瘤细胞和血管的三维重建

注: 图像显示应用多光子共聚焦显微镜对小鼠鳞状细胞癌进行三维重建的两个不同视角。鳞状细胞癌细胞表达胞质标记GFP(绿色)。将TRITC-葡聚糖注射入血管(红色)，使血管被标记。胶原蛋白二次谐波成像显示为蓝色(比例尺:20μm)。

图2-16 体内细胞有丝分裂

注: 表达球蛋白轻链(MLC)与GFP融合蛋白的乳腺癌细胞形成的肿瘤，每隔3分钟进行一次成像。MLC显示为绿色，胶原的近红外线显示为红色。标记星号的细胞从分裂中期(左上)向后期(右下)进行分裂。可以很清楚地观察到MLC在收缩体内的定位，染色体占据的区域在绿色荧光蛋白下表现为黑色区域(比例尺:20μm)。

基因表达可视化:可以通过将感兴趣的启动子放置在编码荧光蛋白基因的上游［26，27］。这样荧光蛋白的表达依赖于启动子的活性，然后通过荧光蛋白水平显像水平“读出”启动子的活性。

2.4.2 活体成像技术显示原发肿瘤的旁分泌作用

肿瘤由许多互相作用的细胞类型组成。在某些情况下，这些相互作用可促进转移的形成。

(1) 与巨噬细胞的相互作用

乳腺瘤和黑色素瘤等不同肿瘤模型的共聚焦成像已经表明，在肿瘤的不同区域肿瘤细胞的行为不同，这种异质性甚至被发现存在于遗传学上相同的细胞系所形成的异种移植肿瘤中，提示这是外在的特异性。肿瘤细胞中的巨噬细胞，通过摄取荧光葡聚糖或者由巨噬细胞特异启动子转基因促使绿色荧光蛋白表达进行可视化显像，在有运动能力的肿瘤细胞区域中存在很多肿瘤相关巨噬细胞［28，29］。用基因敲除小鼠模型［30］和体外共培养系统［31］进行的补充分析表明，巨噬细胞是通过产生表皮生长因子(EGF，它是一种肿瘤细胞的趋化性配体)来促进肿瘤细胞的侵袭(图2-17)。另外，肿瘤细胞集落刺激因子(CSF)的产生也可增加巨噬细胞的EGF生成。

(2) 与免疫系统的相互作用

其他免疫细胞尽管其相互作用的后果并不清楚，但巨噬细胞可调节肿瘤细胞的行为。已经观察到脾细胞与胰腺肿瘤有相互作用，并且这种相互作用的强度随着肿瘤增长而增强［32］。在原发肿瘤中，这种现象的意义还不清楚，但类似的相互作用能促进肝转移的定植，提示脾细胞可能有助于胰腺肿瘤的发生［33］。

免疫系统也能攻击表达异常特异性癌抗原的肿瘤细胞。大量的研究已经将T细胞介导的肿瘤杀伤细胞可视化［34，35］。尽管逃逸免疫系统的攻击对于肿瘤的发展无疑是很重要的，但是至今还不清楚它是否在肿瘤转移中起了特殊的作用。

(3) 肿瘤相关成纤维细胞的多重角色

肿瘤中的成纤维细胞可以促进肿瘤的进展［36］。与正常乳腺比较，乳腺癌组织中胶原蛋白基质的成像显示其组织结构发生了显著变化［37］。在正常乳腺组织中观察到的是部分弯曲整齐的纤维，而在侵袭性肿瘤中发现大型线性胶原蛋白从肿瘤向外“辐射”。胶原结构的大量变化可能是成纤维细胞活性所致。纤维蛋白和成纤维细胞重复成像已证明是肿瘤成纤维细胞导致胶原的重塑［21］(图2-17)。还有研究表明成纤维细胞重塑基质可促进肿瘤细胞的侵袭［38］。与这一发现一致的是，经常观察到肿瘤细胞沿胶原运动或当其遇到新纤维时则改变运动方向(图2-18)。通过对含有血管内皮生长因子(VEGF)启动子操纵GFP表达的小鼠成像发现，VEGF启动子在成纤维细胞中很活跃，提示成纤维细胞是VEGF在肿瘤细胞中的主要来源，并可促进肿瘤的血管生成［26］(图2-17)。

图2-17 应用活体成像研究描述肿瘤微环境变化过程的示意图

2.4.3 原发瘤细胞的运动性与侵袭性

肿瘤细胞需要获得运动能力以“逃脱”原发瘤并在新的组织上定殖生长。细胞运动能力的高度动态特性意味着重复活体成像可产生“缩时”(time-lapse)顺序，对于研究肿瘤细胞的运动性具有很高的价值。这个领域在50年前由Wood开创，其将肿瘤细胞注射入兔耳之前用染料标记肿瘤细胞［39］。即使此后科学技术迅速发展，这项研究依然是一项有创意的工作。

肿瘤细胞运动性的活体成像研究的一项主要发现是:相对较少的细胞具有运动能力。其最可能的原因是在肿瘤微环境中促进运动信号的异质性分布。如前所述，EGF是重要的促进运动的刺激物，肿瘤组织中富含巨噬细胞的区域可能EGF的表达水平最高［28］。通过表达EGF受体以增强EGF信号，提高肿瘤组织中运动性细胞的比例，从而促进转移［40］。在只有一半细胞过表达EGF受体的混合性肿瘤中，只有EGF受体过表达的细胞才表现出运动性增强［40］，表明运动中的细胞尤其需要EGF信号的刺激。

引人注目的是，活体成像显示肿瘤细胞运动可以很快(达10pm/min)［2］，这比肿瘤细胞在体外的运动更快。其原因尚不完全清楚，有可能是趋化物的浓度梯度可指挥体内肿瘤细胞的运动。当然，一般观察到的肿瘤细胞都是朝向共同的方向移动，细胞运动的路径也受细胞外基质结构的影响。图2-18显示一个肿瘤细胞沿着胶原蛋白运动，并且在遇到第二个胶原蛋白时改变运动方向。如前所述，胶原纤维的排列很大程度上受成纤维细胞活性的影响［21］。因此，成纤维细胞对肿瘤细胞侵袭性有显著影响。

运动肿瘤细胞的形状和方向可以非常迅速地改变，因此它们的运动称为“阿米巴样”运动。改变细胞形状可以使肿瘤细胞通过狭小的缝隙(图2-18，下方图)。这可能会绕开蛋白水解，在基质中构成更大的整体。虽然蛋白质水解对形成基质并允许阿米巴样运动很重要，但快速给予基质蛋白酶(MMP)抑制剂并不能阻断这种阿米巴样运动［24］。在极端情况下，细胞运动与收缩结合，可能会导致细胞脱落并产生碎片(图2-18最后一幅图)。

细胞运动性需要肌动蛋白、细胞黏附和肌球蛋白收缩的协同作用(图2-19) ［41］。从体内和体外观察到的细胞运动速度有很大差异，因此从细胞培养系统得出的经验很难应用到肿瘤环境中。最近，在肿瘤组织中进行了肌动蛋白调节子的直接活体成像和实验性操作，已揭示肌动蛋白调节子Mena位于运动细胞的前端，可促进EGF刺激导致的肌动蛋白与丝切蛋白(cofilin)的聚合［23］。由LIMK功能干扰导致的Mena表达上调或丝切蛋白活性增强，都可促进肌动蛋白聚合和细胞迁移［23，42］。还有研究认为上述作用涉及肿瘤细胞中肌动蛋白聚合作用的相关蛋白Arp2和Arp3［41］。

图2-18 肿瘤细胞在肿瘤内的运动

注: 表达胞质标记GFP图的鳞状细胞癌细胞显示为绿色(黄色和橘色箭头为运动中的细胞)，胶原纤维二次谐波成像显示为蓝色。上方3幅图显示两个细胞以相同路径运动(运动细胞用黄色和橘色箭头标注)，并且在遇到胶原纤维时改变方向。下方8幅图描述了一些具有运动能力的细胞高度无组织形态(白色虚线显示一个细胞)，红色箭头是其挤过缝隙的收缩位点。在最后一幅图中看到，细胞遗留下来的碎片(比例尺:10μm)。

如果细胞要移动，就需要与其环境黏附或摩擦。在细胞培养中，细胞基质黏附呈明显焦点状，称为黏着斑。但是这些还没有在活体成像中观察到，说明细胞基质黏附的组织在细胞培养和肿瘤组织中有区别［23］。可能是由于肿瘤组织中存在的是具有弹性的三维基质，而多数细胞培养研究中所采用的是二维刚性基板所致。

细胞培养和活体成像研究不一致性的证据来源于肌球蛋白排列成像。F-肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用可产生收缩力。在肿瘤细胞的细胞培养研究中，F-肌动蛋白和肌球蛋白呈粗线状平行阵列排列，并连接到黏着斑。然而，MLC活体成像证明其分布在细胞皮质，而不是在弹力纤维上［24］ (图2-16)。肿瘤中MLC的排列依赖于ROCK激酶的功能。这些激酶也可以激活LIMK，从而抑制丝切蛋白活性。在细胞不同部分这个机制有可能确保F-肌动蛋白聚合和肌球蛋白收缩的有序进行(图2-19)。

除了少部分肿瘤细胞迅速运动外，多数肿瘤细胞的运动可能很慢。在设计精巧的一项研究中，肿瘤细胞被改造可以表达一种图像转换荧光蛋白。因此在某些范围内的肿瘤细胞在原位被标记为不同颜色，24小时后检测这些细胞的分布，发现很多细胞仅移动了几个细胞直径的距离( ～5nm/h)［7］。但这类运动的研究目前还很少。

2.4.4 内渗

肿瘤细胞可以通过脉管系统传播到远处器官。这个过程的第一步是细胞进入血管，称为内渗。在大部分情况下，内渗涉及肿瘤细胞穿过血管和淋巴管的内皮细胞层，然后完全脱离，此后细胞随血液或淋巴液传播。

在大多数肿瘤中，发生内渗的肿瘤细胞数量很少，这为直接研究此过程造成了困难。但是，已有一些研究者成功地显像了肿瘤细胞进入脉管系统的过程。已观察到，不同转移潜能的乳腺癌细胞以不同方式进入脉管系统［43］。由于巨噬细胞和肿瘤细胞的EGF/CSF-1旁分泌回路的趋化刺激(图2-17)，原发瘤的高转移潜能肿瘤细胞向血管极化。活体成像研究已发现在肿瘤血管周围巨噬细胞数最多的区域易发生内渗［29］。

图2-19 肿瘤细胞在体内运动示意图

注: 趋化因子(用淡紫色标示)与其受体(紫色)结合促进细胞迁移，随后通过与Arp2/3、丝切蛋白和Mena的联合作用引发肌动蛋白聚合并驱动细胞前端(黄色箭头)，细胞其他部分的运动受细胞皮质周围的肌球蛋白相互作用的驱动(黑色箭头)。

已发现EGF受体水平升高的乳腺癌细胞发生内渗的水平增高，进一步提示EGF对内渗的重要性［40］。有趣的是，非转移的肿瘤细胞并非完全没有内渗。这些细胞开始进入血管，但其进入脉管系统后常变成碎片。这表明抵抗血流切变压力的能力对肿瘤的转移很重要。目前，我们对转移细胞应对切变力作用的分子机制还了解得很少。

荧光示踪肿瘤细胞和上皮标记的肿瘤成像揭示肿瘤细胞可能进入脉管系统的另一机制。肿瘤细胞可以形成部分血管壁［44，45］(图2-17)，此时肿瘤细胞通过从管壁上分离而进入血液，而不用穿过内皮细胞层。虽然成像研究已提出了这个机制，但并没有直接观察到。

到目前为止，大部分的研究集中于肿瘤细胞如何进入血流，然而也有很多肿瘤是通过淋巴系统传播。将荧光示踪剂注射入肿瘤，也可使淋巴管可视化［46］。因此肿瘤生长过程中淋巴的调控机制的相关研究受到重视。VEGF-C在肿瘤细胞中的表达可促进淋巴管生成，从而增加淋巴液从肿瘤排出的速度，导致到达淋巴结的肿瘤细胞数量增加［47］。已有研究观察到肿瘤细胞在淋巴管中是流动的，但是其进入淋巴管的过程还未被详细阐明。

2.4.5 外渗并在继发位点初始生存

一旦转移肿瘤细胞进入脉管系统，在流出血管(外渗)进入继发转移位置前保持在血液或淋巴液中流动。对肿瘤细胞在血液中流动的了解多数是来自离体实验，而通过活体成像直接可视化揭示肿瘤细胞贴附血管和外渗的机制是不同的。

(1) 在血管中肿瘤细胞被捕获

在血管中细胞被捕获的最简单方式是大小限制。相对较大的肿瘤细胞会物理性地卡在狭小的毛细血管中(图2-20)。例如，采用活体视频显微镜已经直接观察到在肝血窦中肿瘤细胞的捕获［48］。另一种捕获机制是肿瘤细胞对内皮细胞或位于内皮细胞下基膜的主动黏附(图2-20)。活体成像显示人纤维肉瘤细胞可以通过附着位于内皮细胞下方的基质而在肺中被捕获。这个过程依赖于蛋白素α3β1在肿瘤细胞表达，并与内皮下基膜上层粘连蛋白-5的结合［49］。肿瘤细胞和血小板结合可增强主动和被动捕获。早在20世纪50年代末就已注意到在脉管中，被捕获的肿瘤细胞周围迅速形成血栓的现象［39］。近来更多应用荧光标记抗体的研究显示肿瘤细胞与如血小板或纤维蛋白原等血液凝固成分的相互作用对于肿瘤细胞滞留在肺部是必需的［50］。另一项工作发现在纤维蛋白原缺乏或血小板功能缺失的动物其肿瘤转移率降低，进一步支持这一发现［51，52］。

(2) 肿瘤细胞离开脉管系统

一旦肿瘤细胞被捕获，它们一般在几小时内穿过内皮进入继生组织，这个过程称作外渗(图2-20)。对于这个过程的了解大多来源于联合应用体外模型和实验性转移，后者测量可以形成肉眼转移的肿瘤细胞。因此，现有的有关知识主要基于推论。通过体内成像技术直接观察外渗具有相当的应用空间，将有助于进一步了解外渗过程。

在某些情况下，肿瘤细胞在继发位点的早期生长并不需要外渗。有人观察到，一旦肿瘤细胞附着在内皮细胞上，就可以在血管中增殖［53］。随着时间的推移，血管中的细胞克隆越来越大，最终穿破内皮组织进入周围组织(图2-20)。

图2-20 血管中的肿瘤细胞及其外渗

注: 图中描述了肿瘤细胞黏附在血管的不同方式。1.肿瘤细胞通过主动黏附于内皮细胞及其基膜而被捕获。2.肿瘤细胞可以被捕获是因为它们比要通过的毛细血管的直径大。3.通过内皮细胞层外渗。4.肿瘤细胞被捕获后可在血管内开始增殖。5.肿瘤细胞还可以在开始增殖前外渗出去。

(3) 在继生位点的肿瘤细胞如何被快速清理

在将肿瘤细胞注入脉管系统的实验中，绝大多数最初捕获的肿瘤细胞在几个小时后并没有被检测到(图2-21)。这种现象有几种可能:与内皮细胞间的黏附强度可能是帮助肿瘤细胞抵抗血流压力的关键因素。另外，一旦肿瘤细胞离开了它们起源组织的促生长信号，便更容易凋亡。在黑色素瘤肺转移模型中通过BAD与GFP融合，已经直接观察到凋亡调节子BAD从健康细胞质移位到死亡细胞的线粒体［54］，还发现在肝内捕获的肿瘤细胞出现典型的凋亡核形态改变［55］。

新到的肿瘤细胞的死亡可由周围内皮细胞主动诱发。内皮细胞所产生的一氧化氮(NO)增加，对肿瘤细胞有毒性作用，这已通过应用对NO敏感的荧光探针在体内成像中显示［56］。

图2-21 乳腺癌细胞到达肺的时相分析

注: 图像所示表达GFP膜标记的肿瘤细胞(绿)经过注射后在不同的时间到达肺内的情形。上方图仅显示肿瘤细胞本身，下方图显示在成像前立即经尾静脉注射血管标记，血管显示为红色，肺组织反射成像(白色)，自体荧光呈蓝色。注射后20分钟，许多细胞在肺中被捕获，有的为块状(方框内图像)。第90分钟，虽然观察到很多细胞碎片，但仍可以观察到较少的完整细胞(方框内图像)。24小时后，只有少数细胞存在。1周后，有些细胞形成较大转移灶(右上图)，或小转移灶(左下图)(比例尺:50μm)。

由于黑色素瘤细胞周围的内皮细胞可产生NO而导致其死亡，这在内皮型一氧化氮合成酶(e NOS)缺陷的小鼠中却不会发生这种情况，从而导致这些小鼠中出现大量肿瘤转移。然而，肿瘤中NO的功能仍存争议，似乎依赖于其来源细胞或组织，因为已经发现肿瘤细胞生成的NO能够促进肿瘤进展［57］。肿瘤细胞也可能在继发位置被部分免疫系统攻击。尽管尚未有显像研究显示转移位点存在免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤，但许多研究已经表明多种免疫抑制剂能够促进肿瘤转移［55］。

2.4.6 在继发位点生长

为了形成转移灶，到达继发位置的肿瘤细胞需要增殖。全身成像是监测该过程的简单有效的手段。肿瘤细胞被修饰以表达编码荧光和生物发光蛋白基因，使其能够在动物细胞中得到追踪和量化，已有报道黑色素瘤在大脑、肝、骨等不同器官的增殖情况［58］，或胰腺肿瘤细胞在脾、肠、淋巴结和肝中的转移［59］。从临床和实验研究都能清楚发现不是到达继发位置的肿瘤细胞都能形成明显转移灶。图2-21表明，在1周后，一些实验性肺转移灶仅仅包含很少的细胞，而另外一些却包含100个以上的细胞。这可能要用肿瘤干细胞假设来解释［60］。根据这个学说，仅部分肿瘤细胞拥有无限繁殖的能力，因而产生明显转移;而增殖能力受限的肿瘤细胞则会形成小转移灶。当然尚需进一步研究证实。

更惊人的是，在原发肿瘤已被切除多年的肿瘤患者身上发现单个或者小转移灶。这些细胞通常被称为“休眠细胞”［61］。在乳腺癌等癌症，转移灶的生长有时会延迟数年后才发生。这是一个很棘手的临床问题，因为没法评估手术是否为根治性，或病人是否需要持续化疗。小转移灶再生的原因是有争议的。一个可能的原因是休眠细胞进一步突变导致其重新增殖，也有可能是局部环境的变化导致旁分泌相互作用的改变，并因此恢复增殖。如前所述，甚至细胞还在血管中的时候就开始了重新增殖［62，63］。

2.4.7转移位点旁分泌的相互关系

不同肿瘤转移好发于不同器官。例如，乳腺和胰腺肿瘤好发骨转移，而结肠肿瘤多数转移到肝。这些现象可用血流模式解释(从结肠中离开肿瘤细胞经过的第一个毛细管床就是肝)。有一个问题已争论了好多年，即肿瘤细胞转移的组织中肯定存在某种物质可以促进特定细胞生存和增殖，而对其他类型细胞则没有作用。活体成像有助于揭示体内特定转移位点中特定的旁分泌相互作用。与原发瘤相似，肿瘤细胞在继发位点与其他细胞相互作用以促进其持续增长。将标记了一种颜色荧光蛋白标记的肿瘤细胞注入用另一种颜色荧光蛋白标记的小鼠中，就可以观察旁分泌的相互作用。结肠癌细胞经常与脾细胞一同进入肝。通过实验操作检测随结肠癌细胞一同进入肝中的脾细胞水平，发现脾细胞可促进转移灶定植［33］。然而，脾细胞帮助肿瘤细胞在肝中定植的机制还不是很清楚。

细胞因子TGF-β信号成像证明其在骨转移中特别高［64］。进一步分子分析证明TGF-β信号的众多靶基因可以促进破骨细胞的功能，包括白细胞介素(IL)-11［65］。因此，肿瘤细胞TGF/S信号的增强可促进破骨细胞降解骨组织并产生肿瘤细胞增殖所需要的空间［64］。在另一项研究中，鼠薄头骨骨髓成像显示，表达CXCR4的白血病细胞优先转移到含有其配体SDF-1的骨髓微区［66］。因此，骨髓中可以激活肿瘤细胞趋化因子信号的区域更利于定植。另外一些研究显示SDF-1信号可以活化整合素，而整合素可介导造血细胞和血管黏附［67］。因此SDF-1信号可能帮助肿瘤细胞黏附到血管壁而促进转移［64］。

骨髓来源的细胞可以促进转移灶在骨外位点的定植。例如，VEGFR-1阳性骨髓来源的细胞可促进肺转移。详细的频谱时间分析显示，这些细胞在肿瘤细胞之前到达肺组织。虽然产生的SDF-1再一次牵涉其中，但仍不清楚具体这些细胞是如何促进转移的［68］。这些细胞从骨髓的迁移主要受由原发瘤产生的因子所驱动。旁分泌的相互作用不仅在局部促进转移，在全身水平也有作用。

2.4.8 活体成像作为治疗的工具

(1) 在动物模型中跟踪转移

肿瘤转移是一个重要的临床问题，可以降低其发生率的疗法对癌症治疗有显著的影响。肿瘤转移的多步骤特性对干预转移提供了很多机会。然而，在临床前模型中识别哪个目标对于肿瘤转移最为重要，并且后续发展为临床有用治疗手段仍然是巨大的挑战。

活体成像正在迅速成为临床前评估抗转移药物的重要工具。首先，全身成像可以提供在不同遗传特性或药理干预后肿瘤播散和生长的纵向数据，在骨转移研究中已显示了明显的效用。如前所述，在溶骨性转移的骨重塑由破骨细胞与乳腺癌细胞协同发挥作用［64］。应用双膦酸盐类药物可以阻止骨重塑，全身成像显示这些药物可降低乳腺癌模型骨转移灶的生长［69］。由此证明了靶向非肿瘤细胞可减少转移。这个方法也可以用于评价联合化疗抗转移［70］。

(2) 在细胞或分子水平评价药物的疗效

更高分辨率的活体成像也可以用于评估药物是否特定地阻断预先设计的目标过程，因此已经开发了多种可以在体外降低肿瘤细胞侵袭性的药物。然而，评价其在体内的效果是更大的挑战，因为它们不会按预期那样影响肿瘤大小等简单参数。

致癌酪氨酸激酶c-src可以破坏上皮细胞之间的黏附连接，将这些连接打破是转移过程的重要早期步骤。黏附连接蛋白的动态对照和src抑制处理的肿瘤成像证明，src确实可调节体内黏附连接蛋白的功能。为研究在细胞分辨率上评估抗src药物的临床效用，这种成像技术是非常有用的方法［71］。

如前所述，高分辨率成像有能力真实地观察到运动性肿瘤细胞，还可以与药剂管理相结合。抑制基质金属蛋白酶(MMPs)可阻止肿瘤细胞的侵袭从而降低转移。事实上，活体成像显示其对体内观察到的“阿米巴样”快速运动肿瘤细胞的数量影响甚微，这可以解释在临床治疗中抗MMPs药物的作用有限［72］。相反，药物抑制可以调节肌球蛋白收缩的激酶ROCK1和ROCK2，降低体内肿瘤细胞的能动性［24］。有趣的是，ROCK抑制剂无法完全抑制肿瘤细胞的运动能力，并发现一群具有独特形态的细胞并未受到影响［73］。这个例子说明，应在细胞水平非常详细地研究和分析药物如何发挥作用和如何能够提供反应异质性或耐药细胞群的早期迹象。

抗癌疗法也可以靶向支持肿瘤的非肿瘤细胞，它们的活动也可以通过活体成像研究。大于一定体积的转移灶需要血液供给提供营养和氧，因此也对抗血管生成药物敏感［74］。活体成像显示了两种不同的抗血管生成药物如何改变肝转移中的血管网络和血流，并抑制肝转移灶的生长［75］。靶向淋巴管也可能在降低淋巴转移肿瘤方面有益处。有人报道，VEGFR-2和VEGFR-3拮抗剂可抑制实验性纤维肉瘤的引流淋巴网［47］，也与纤维肉瘤细胞到达淋巴结数量降低有关。然而，VEGFR拮抗剂只有在肿瘤淋巴管形成之前应用才有效。这说明它们不能降低已形成淋巴管的肿瘤淋巴转移，因此在临床上不能很好地发挥作用。

有研究在激素松弛肽处理的小鼠体内观察基质成纤维细胞和胶原纤维的重复成像，证明了激素如何利用成纤维细胞影响胶原蛋白的重塑［21］。考虑到胶原纤维在体内调节肿瘤细胞迁移行为的重要性，很有可能采用松弛肽处理以改变肿瘤细胞的侵袭行为。然而，这还需要直接检测。

这里描述的抗癌药物对细胞行为作用的详细分析研究仍然处于初级阶段，与转移行为的联系并不总是明确。尽管如此，这些研究提供的详细信息有助于我们在临床试验前，预测和克服临床前期模型治疗策略的相关问题。

(3) 将药物传输到靶组织的评估

在更多的技术水平上，成像可以评估药剂到达肿瘤，特别是到达肿瘤内特定区域的效率。这有助于设计修改促进药剂到达靶组织的传输。典型的例子是示踪抗乳腺癌抗体他莫昔芬(Herceptin)，其靶蛋白是Erb-B2，是在乳腺癌细胞中高表达的EGFR家族成员。在乳腺癌或神经胶质瘤的小鼠中研究荧光标记的他莫昔芬及其衍生物的分布，活体成像显示他莫昔芬可特异地结合乳腺癌［11］。此外，通过测量肿瘤潴留动力学或在肾脏中的积累来分析此抗体的不同变体的分布情况［76］。

另一个改进传送药物的方法是调节减少其进入肿瘤的障碍。周围的细胞外基质(ECM)可以减少脉管系统的微粒扩散进入肿瘤的比例。如前所述，激素松弛肽可以降低ECM的密度;活体成像证明这可以导致微粒扩散进入肿瘤的比例增高［77］。这些研究在临床上可以设计促进药物传送和采用活体成像的方法检测的可能性。

2.4.9 结论

很多年来，转移的研究都被称为“黑匣子”研究，因为唯一能评估的是过程的起点和终点，这意味着对这一过程的许多了解是基于推理或体外模型。成像应用到肿瘤转移的研究中是监视转移活动最为关键的手段，并且极大地提高了我们对这一过程的认识。然而，还有很多问题有待探究，特别是揭示旁分泌相互作用影响肿瘤转移的可能性和位点的途径，以及一旦进入继发位点，是什么决定肿瘤细胞的生长或保持休眠。

(乔鹏译，钦伦秀审校)

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