◎Brunilde Gril,Russell Szmulewitz,Joshua Collins,Jennifer Taylor, Carrie Rinker-Schaeffer,Patricia Steeg,Jean-Claude Marshall
20世纪70、80年代,科学发现和技术革新使我们对肿瘤生物学的分子机制迅速有了深入理解。癌基因、抑癌基因的发现及其功能的阐述,极大地帮助在分子水平上开展对原发性肿瘤病因学的研究。尽管如此,肿瘤生物学家对于肿瘤细胞转移的分子机制仍知之甚少。考虑到肿瘤细胞造成的破坏性后果,科学家期望能有所突破,或许首要的突破口就是肿瘤抑制基因的研究。
肿瘤抑制基因是在研究其功能缺失对肿瘤的发生起决定性作用时被识别的。在抑癌基因发现之前,研究者们一直认为原癌基因总是起着主导作用。换句话说,仅仅单个等位基因突变即可造成正常细胞转化成肿瘤细胞。然而,不是所有的发病率数据都完全符合这个假说。例如,对视网膜母细胞瘤发生的研究就提出了“二次突变”假说,推测至少在某些肿瘤中,细胞成功地发生恶变必须出现两个突变(在各自的等位基因上)[1]。的确,视网膜母细胞瘤基因(Rb)是第一个发现的肿瘤抑制基因。如今我们认为由于启动子的高度甲基化,“二次突变”不一定以稀少的体细胞突变形式出现,也可以是生殖细胞突变和(或)体细胞突变、体细胞重组、基因转换和基因功能失活等各种原因造成。已报道的抑癌基因有很多,目前认为常见的抑癌基因包括Rb、p53、APC、PTEN、TSC1和NF1等。
但是,这种理解转移进展是有问题的。目前普遍认为转移的过程非常复杂,转移机制的研究非常困难。而且,一旦肿瘤细胞脱离原发灶,患者最终出现转移仅仅是时间问题。正是基于这样的科学背景,1988年,Patricia Steeg和他的同事提出这样一种假说:类似于肿瘤抑制基因,也存在着转移抑制基因。一旦它们功能性缺失,会使细胞获得转移能力[2]。为了验证这一假说,他们利用32P标记mRNA探针筛选高低转移潜能的黑色素瘤细胞系cDNA文库[3]。利用差示杂交策略,发现只有一个cDNA克隆,即非转移克隆#23 (Nm23),呈现出假说中的表达模式。在低转移潜能的细胞系中,Nm23m RNA表达水平最高,而在高转移潜能细胞系中,几乎检测不到它的表达水平。
体内功能研究表明,在高转移的人和小鼠细胞系中转染Nm23,再注射到小鼠中,转移潜能明显下降,尤其是肺转移下降了96%。这些数据证实了Nm23是第一个转移抑制基因[4,5]。而且,这项研究提供了直接的分子和生物学证据,证明肿瘤形成和转移是独立事件,这意味着可以专门研究肿瘤转移这个领域。
Nm23的发现开创了新的基因功能研究领域——转移抑制基因(MSG),目前发现的转移抑制基因有20多个。一般认为,肿瘤转移抑制基因能抑制自发的转移过程,而不影响原发肿瘤生长。尽管这是一个新兴的研究领域,但目前的研究表明肿瘤转移抑制基因可调控肿瘤转移多重步骤的一系列信号通路(图3-3)。如调控细胞进程和(或)细胞凋亡的MAPK信号通路中MKK4、MKK6和MKK7;而Rho GDI2通过抑制Rho调节细胞骨架重组和细胞运动。前者抑制转移克隆形成,而后者抑制转移侵袭。体内机制研究已经表明,肿瘤转移抑制基因是调控转移形成的限速步骤,因而成为具有广阔前景的分子靶点。
3.2.1 MSG的鉴定和验证策略
许多技术可用于筛选候选的肿瘤转移抑制基因,包括差减杂交法、差异显示、微细胞介导的染色体转移(MMCT)技术和生物芯片分析。目前后两项技术已被证明特别有用。
在寻找MSG的早期阶段,通过MMCT技术发现了许多候选基因。简单地说,MMCT通过抑制生长细胞的有丝分裂,化学性破坏有丝分裂纺锤体,使得聚集的染色体自由漂移[6]。这些自由的染色体以细胞膜为边界,形成包含单个和多个染色体的微核重返细胞周期。随着进一步的化学处理和差速离心、过滤,形成了包含单个染色体的微细胞。包含感兴趣染色体的微细胞融合成受体细胞——也就是转移肿瘤细胞。如果新形成的杂交细胞被发现有抑制转移潜能,那么一系列的定位克隆技术能够在转移的染色体上准确定位感兴趣的基因。
最近芯片技术的发展大大推动了肿瘤转移抑制基因的发现。理论上讲,芯片的原理很简单。寡核苷酸探针以微阵列形式化学性附着在玻璃或硅基质上,当带有荧光标记的纯化RNA与基因芯片上对应的核酸探针杂交时,通过确定样本相对于标准品的荧光强度,就可以确定这些基因表达是上调或下调。这种芯片技术利用皮克级核酸产物一次可以分析数千个基因。通过比较有无转移的细胞系或临床手术肿瘤样本中表达下降的基因,以达到鉴定发现候选MSG。
图3-3 转移级联反应示意图及不同转移抑制基因参与转移级联反应的可能步骤
通常提出一个候选的MSG后,随之进行一系列验证试验。候选的MSG体外抑制肿瘤转移特性,如降低细胞运动、侵袭、锚定非依赖性生长和血管生成。然而,MSG必须在体内能证明其功能。一方面是因为转移过程太复杂,没有足够好的模型来证明体外实验;另一方面需要对原发瘤生长的结果进行监控。
对一个候选的MSG进行体内功能验证一般是将候选基因转染到高转移细胞系中上调其表达,被转染的细胞通过一两种常规方法注射到动物中[7]。第一种方法,被认为是黄金标准,原位接种转染的转移细胞,这样可以形成原发灶,完成转移阶梯反应中的每一步,因而可以对转移率和数目进行定量。第二种方法涉及实验性转移,直接将细胞通过静脉或心内注射到动物的循环系统。产生的转移之所以被认为是实验性的,是因为它们有效地跳过了转移的起始步骤。为了和MSG的定义相一致,同时皮下接种或者原位接种转染的细胞,确定原发灶的大小。
模型系统的经验能够给生物统计学家提供必需的数据,从而挖掘合适的统计学方法或模型以供研究,这也使得生物信息学得到发展,以确保这些数据会提供一些有意义的结果。因为多数转移模型具有相当大的异质性,数据的准确至关重要。因此,生物统计学也完全渗透到实验设计、实施和评价等转移研究实验中。
尽管利用光学和分子成像技术对于体内研究转移让人兴奋,但研究者必须注意到每一个成像技术的局限性。生物成像技术在提高其检测灵敏度、改善实验和个体动物的纵向研究的质控等方面可能有用。然而,这不是一个捷径,也并不意味着可以跳过体内实验的艰苦研究或昂贵的花费。在生物统计实验设计中,必须设计合适的实验对照,并采用病理切片(金标准)确认分子成像结果。
不管用什么方法,只要基因能显著地降低转移灶的数量,而不影响原发灶的生长,就可以摆脱“候选者”的身份,成为真正意义上的MSG。
3.2.2 MSG和转移性殖生
当循环肿瘤细胞随着血液循环转送并在其中存活、在继发位点血管内定居即开始形成转移性殖生(metastatic colonization)。这些播散细胞的命运很复杂,既可以外渗到周围基质,也可以留在血液循环系统中。在任何位置,它们都会经历增殖或凋亡,或者在很长一段时间保持休眠状态。转移抑制研究的成果证明了之前的发现:原发瘤与转移位点的肿瘤细胞生长并不相同。许多临床前药学研究证明了原发瘤和转移灶的生长完全不同[8]。由此可以得出:原发瘤生长的通用原则并不能完全用于理解转移性殖生。近年来的研究开始提出,肿瘤细胞与微环境的相互作用决定了肿瘤转移的最终归宿,转移抑制基因被证明是体内转移研究中的一个重要工具。
在临床上,认为转移性殖生是一种理想、但迄今还未被采用的治疗靶点。以乳腺癌为例,一旦一个患者被诊断为淋巴结阳性,说明已经发生转移,极有可能癌细胞已经扩散到脉管系统并已在继发位点定居,意味着癌细胞只需存活、增殖并最终完成殖生过程。MSG看上去可特异性地影响转移灶克隆的形成,因此,以MSG和相关的信号通路为分子靶点可以发展分子靶向治疗。或许可以通过延长已扩散的肿瘤细胞的休眠来改变疾病模式,使得癌症成为一个临床上可以治疗的慢性疾病;甚至在其他辅助条件下杀死已扩散的癌细胞,彻底抑制肿瘤转移的形成。
3.2.3 已知的肿瘤转移抑制基因
自从1988年Nm23被发现以来[9],候选肿瘤转移抑制基因的数目已经增加到20多个(表3-2)[10,11]。在此,我们会关注在多种肿瘤细胞系或体内自发肿瘤转移实验中最有特点的MSG[11]。
表3-2 已发现的MSG及其肿瘤转移抑制功能的证据
续表
(1) Nm23-H1
最初被称之为非转移性克隆23,通过比较高低不同转移潜能的黑素瘤细胞系c DNA文库发现了Nm23-H1。在5个高转移潜能细胞系中,它的表达量明显低于两个相关的低转移潜能细胞系。在那个时代,一个基因影响细胞远处转移的观念是有争论的。现在回想起来,这是合理的,因为实验数据证明转移能力的获得需要复杂的细胞功能,这些功能的损失会导致细胞无法转移[2]。自从Nm23-H1被发现,它的转移抑制功能在多种肿瘤模型中被确认,包括黑色素瘤[12]、前列腺癌[13]、结肠癌[14]、乳腺癌[15]和口腔鳞状细胞癌[16]。Lacombe和她的同事通过遗传学方法也证实了Nm23-H1抑制转移的效应[17]。他们发现在Nm23野生型和基因敲除小鼠中,肝细胞肿瘤形成率没有差异,但基因敲除小鼠中肺转移率是野生型小鼠的两倍(P< 0.001)。体外过表达Nm23-H1可降低乳腺癌细胞的迁移能力(图3-4)。但Nm23-H1上调并不一定与抑制肿瘤转移相关。事实上,在白血病和神经母细胞瘤中,Nm23促进转移。这些发现表明Nm23抑制肿瘤转移潜能具有环境依赖性和组织依赖性,尽管这些差异的原因仍待阐明。
图3-4 胎牛血清作为趋化因子对Nm23-H1过表达细胞迁移能力的影响
Nm23抑制转移的生化机制有可能极其复杂。人类一共发现了8个不同的Nm23同源染色体,但广泛研究的只有Nm23-H1和Nm23-H2[18,19]。Nm23-H1与EPK1/2MAP激酶支架蛋白[也称为Ras激酶抑制剂(KSR)]相互作用,可抑制ERK1/2活化[20]。在其他模型系统中,肿瘤休眠被认为是p38和ERK1/2之间处于动态平衡,ERK1/2活化促进细胞增殖,p38活化则促进细胞死亡,而两者达到平衡时细胞处于休眠状态。尽管这一点并没有得到正式验证[21-23], Nm23-H1抑制ERK1/2的作用有利于调节这一平衡状态。Nm23特异性结合一些蛋白包括酪蛋白激酶2、Rad、Epstein-Barr病毒的潜在抗原和异源三聚体G蛋白,发挥其功能。其他一些有利于Nm23发挥转移抑制作用的分子包括组氨酸蛋白激酶、核苷二磷酸激酶和DNA外切核酸酶[24]。
对照和Nm23转染细胞系的基因表达谱分析证明, Nm23下游分子可能也参与肿瘤抑制效应。基因芯片分析对照和高表达Nm23乳腺癌细胞系的下调基因产物发现包括EDG2在内的多个兴趣蛋白。以前认为EDG2及其同系物EDG4、EDG7与肿瘤的生长、转移密切相关[25],而且它们是血清中主要成分,是富含磷脂的溶血磷脂酸受体。发现溶血磷脂酸(LPA)通过这些受体可特异性促进卵巢癌的转移。Nm23-H1抑制EDG2的表达认为是Nm23-H1在抑制肿瘤运动、侵袭和转移中发挥了至关重要的作用[25,26]。此外, EDG2的过度表达能够消除Nm23-H1抑制肿瘤细胞在继发位点的细胞滞留、黏附和生长。总而言之,EDG2可能成为Nm23-H1低表达转移性乳腺癌患者的另一个抗转移的分子靶点。血液中溶血磷脂酸水平始终相对稳定,然而许多肿瘤细胞可产生或分泌自体毒素,从而可能形成溶血磷脂酸的工作浓度。因此,针对肿瘤细胞中EDG2作为靶标极有可能抑制细胞不断形成转移灶。
由于MSG抑制转移的能力,它们是一个很有前景的治疗靶点。现在已有一些化合物能够增强哺乳动物肿瘤细胞中的Nm23表达,从而降低转移。在三阴性乳腺癌细胞系中(ER阴性、PR阴性和Her-2野生型),通过甲孕酮(MPA)处理后,Nm23-H1的表达增加了两倍。一般认为,这种活化是甲孕酮结合在糖皮质激素受体作用的结果[27]。为了验证MPA增强Nm23表达的假说,转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-231静脉注射到老鼠中,4周之内形成了微小肺转移灶,之后老鼠被随机分成甲孕酮处理组和对照组。8~10周甲孕酮常规处理的老鼠转移灶的发生率下降27%~40%,平均转移数量下降44%~48%。甲孕酮的不良反应是体重增长,但对骨密度、肥瘦比或乳腺脂肪垫组织没有明显影响。在印第安纳大学已开展了一个独用高剂量甲孕酮以及结合节律性化疗的II期临床试验。在过去的20年中,Nm23已从一个概念逐渐转变成一种机制,虽尚未能转化到临床应用,但已证明研究转移过程中转移抑制基因的可行性和实用性,其他转移抑制基因和模型系统的不断丰富,完善了转移性克隆形成的知识内涵。
(2) Kiss-1
Kiss-1于1996年被发现,在乳腺癌和黑色素瘤实验模型中过表达Kiss-1c DNA可抑制肿瘤转移,但对原发灶的生长没有任何影响[8]。Kiss-1 编码分泌的多肽——kisspeptins,这在 MSG 中是独一无二的。已发现多个kisspeptins包括metastin(一个编码54氨基酸多肽)。一般认为,metastin结合G蛋白偶联受体 GPR54 可抑制转移[28,29]。GPR54受体和它的配体——metastin,之前被认为在青春期起作用[30]。
有证据表明,Kiss-1/metastin可促进实体瘤细胞在继发位点休眠[31]。在实验中,用荧光标记的皮肤黑色素瘤细胞通过静脉注射到无胸腺的裸鼠中,荧光蛋白的稳定表达使得整个实验过程可视化。将转染了空载或kisspeptin分泌信号缺失的细胞注射到裸鼠,35天后肺、骨骼、肾和眼睛中均观察到较大的转移灶。相反,将过表达野生型kisspeptins黑色素瘤细胞注射到裸鼠,一直到120天,在多个器官中没有观测到肿瘤细胞生长,它们仍处于休眠状态。这些数据表明,一旦肿瘤细胞到达继发位点,分泌的kisspeptins在维持黑色素瘤细胞休眠中起了重要作用。然而自相矛盾的是, Kiss-1在黑色素瘤细胞中诱导休眠的机制并不需要GPR54受体,这意味着还有其他受体在起作用。尽管阐述这个分子机制需要更进一步的研究,但对于已扩散的癌症患者而言,这样一种分泌肽是一个有临床前景的药理学靶点。
(3) Kai-1
另一个促进实体瘤细胞休眠的MSG是Kai-1,也被称为CD82,是1991年发现的含有267氨基酸的跨膜蛋白,它涉及抑制癌细胞的侵袭和转移[32]。tetraspanins是含有4个跨膜结构的细胞表面蛋白大家族,能和整合素结合形成复合物[33]。最近的研究表明,Kai-1除了抑制细胞的侵袭和转移之外,也可抑制肿瘤转移级联反应的晚期阶段。Kai-1还可与内皮细胞表达的含有7个跨膜结构Duffy抗原趋化因子受体(DARC)相互作用[34]。利用乳腺癌、黑色素瘤和前列腺癌细胞系,分析不同表达水平的Kai-1细胞与DARC阳性内皮细胞的结合能力,高表达Kai-1前列腺细胞显示出较高的亲和力。癌细胞通过Kai-1/DARC与内皮细胞相结合,可诱导癌细胞生长停滞,减少体外克隆的形成。但没有检测到细胞凋亡。体内分析DARC基因敲除的小鼠,与野生型和杂合型乳腺癌、黑色素瘤细胞系的对照相比,发现DARC基因敲除小鼠中导入Kai-1阳性克隆可显著促进肺转移。这些数据表明DARC在Kai-1抑制转移过程中是必需的。肿瘤细胞的生长停滞与TBX2减少和抑制细胞周期蛋白CDK2、CDK4复合物P21的上调相关。之前的研究表明, TBX2通过抑制黑色素瘤细胞P21表达来抑制衰老,这说明P21通路可能在肿瘤进程和休眠中发挥重要作用[35]。现在证明泛素连接酶Gp78可促进Kai-1的降解,从而降低其蛋白表达水平[36]。通过抑制Gp78的活性,可以抑制Kai-1在细胞膜上降解,导致体内肉瘤细胞系转移潜能降低。或许可以在这些细胞中通过抑制Gp78及维持Kai-1水平而成为有潜力的靶向治疗。
Kai-1的另一个作用机制与其抑制Met和Src的活化相关[37]。利用人的前列腺癌细胞发现Kai-1可和整合素介导的信号通路相互作用,Kai-1的增加可抑制c-Met配体——HGF活化c-Met的能力。另外,Kai-1通过整合素介导,诱导Src失活和相应的细胞侵袭、转移能力的降低;这也表明癌细胞中Kai-1的缺失可以激活c-Met和Src的信号通路,反过来促进细胞的运动和转移,使细胞的恶性程度增强。这也提示下游分子可以针对模拟Kai-1效应,降低肿瘤细胞的转移。
(4) JNKK1/MKK4、MKK7和MKK6
JNKK1/MKK4是通过微细胞介导的染色体转移技术、定位克隆策略和体内转移分析相结合发现的一个由17号染色体编码的转移抑制基因,它参与应急活化蛋白激酶链的MAP2K[38]。最初的研究表明,JNLL1/MKK4过表达后,前列腺癌肺转移数量可降低90%[39]。利用卵巢癌移植瘤模型发现该蛋白在转移性癌中起着广泛的作用[40]。在人卵巢癌细胞系中表达JNKK1/MKK4,可见的转移灶明显减少,注射的动物寿命增加了70%。在这两个模型系统中,JNKK1/MKK4激酶的活化是发挥转移抑制作用所必需的[39,41]。
促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是将外部信号转换成直接控制细胞进程的一系列下游分子的一类蛋白[42]。哺乳动物细胞中的MAPKs包括ERK1/2、ERK5、JNK和p38。MAP3Ks激酶的活化可启动磷酸级联反应,反过来磷酸化MAP2Ks,进一步磷酸化最终目标MAPK。MAP2Ks磷酸化单个目标MAPK(JNKK1/MKK4除外);然而,MAP3Ks被认为能够磷酸化多重MAP2Ks,对不同的刺激均有特异性反应信号。细胞外信号调节激酶(ERK)信号一直是肿瘤研究关注的焦点,在细胞增殖、转化和ras原癌基因下游的恶性进程中起作用。JNK和p38 MAPKs是应激活化蛋白激酶(SAPK)信号通路的一部分,传统上与细胞生长的停滞和凋亡相关,因此它们通常被认为是肿瘤形成和进程的抑制者。
JNKK1/MKK4与多种临床肿瘤有关,大约5%的肿瘤存在JNKK1/MKK4基因功能性缺失突变。而且,多种肿瘤(如肺癌、胰腺癌、乳腺癌和睾丸癌)存在JNKK1/MKK4基因位点杂合性缺失[43-46]。Xin等发现与MKK4阳性的胃癌患者相比,MKK4阴性患者的寿命减少近50%,而且转移灶中JNKK1/MKK4的表达明显高于原发灶[47]。同样,在一个胃腺癌的回顾性研究中,原发灶中JNKK1/MKK4表达缺失的患者死亡风险增加5倍[48]。Stark等发现,在乳腺肿瘤脑转移患者中,JNKK1/MKK4 m RNA 表达水平降低,说明JNKK1/MKK4的缺失与转移形成有关[49]。在前列腺癌患者中,通过免疫组化发现JNKK1/MKK4表达水平与格里森分级呈明显负相关[50]。
虽然临床发现并不一致,这也突出了调控肿瘤SAPKs作用的复杂性。在特定的环境下,JNKK1/MKK4和JNK与肿瘤的进程密切相关,p38也是如此[43,51]。例如,在缺少JNKK1/MKK4的胰腺和乳腺癌细胞系研究中,外源表达JNKK1/MKK4导致细胞克隆形成和侵袭能力增加[52]。在一个胰腺癌的临床前实验中,与MKK4杂合突变的肿瘤细胞相比,MKK4纯和突变的细胞会形成较少的实验性(静脉的)转移,肿瘤形成慢了1倍[53]。而且,与Kim等研究相反, Lotan等最近的研究显示JNKK1/MKK4和MKK7的表达上调与前列腺癌临床高分期相关[54]。
为了进一步探讨JNKK1/MKK4在调控肿瘤转移中扮演的角色,体内功能研究表明,不仅其表达水平,其激酶活性对于抑制卵巢癌和前列腺癌的转移都是必需的[39,41]。这说明蛋白是通过激酶级联反应活化下游JNK和(或)p38的底物来调控细胞增殖。有趣的是,实验室转移模型系统的体内研究显示,JNKK1/MKK4的活化并不能引起人卵巢癌细胞系SKOV3ip.l的凋亡[55]。反之,在JNKK1/MKK4表达的微小转移灶中,通过Brd U标记观察到增殖停滞和组蛋白3的磷酸化。这与细胞周期抑制物p21Wafl/Cipl的表达上调显著相关,表明JNKK1/MKK4是通过诱导细胞周期停滞来减少转移灶克隆的形成。
另外机制研究也提示,在这个模型系统中JNKK1/MKK4是通过p38的SAPK信号通路发挥作用[41]。另一方面,AT6.1前列腺癌移植瘤模型的数据也发现JNKK1/MKK4通过JNK信号抑制肺转移灶中播散细胞的生长[39]。然而,在这个模型系统中,抑制作用究竟是由细胞凋亡导致的,还是由细胞周期停滞来介导的,仍有待进一步探索。
这些体内临床前研究对于理解SAPK信号通路在肿瘤进程中的作用有着许多启示。理解细胞类型和微环境如何决定一个刺激物通过同一个激酶影响不同的目标分子,对于设计特定的临床治疗药物至关重要。另外,尽管理解JNKK1/MKK4在分子水平上如何影响不同的信号相当重要,但最终导致细胞相同的命运也同样重要。前列腺癌中JNK信号通路的活化和卵巢癌中p38信号通路的活化同样都抑制转移性生长,目前已有一些手段可以阐述这些机制。
(5) BRMS1
同JNKK1/MKK4一样,BRMS1也是通过微细胞介导的转移技术将11号染色体转染到人的乳腺癌细胞系中发现的MSG[56]。11号染色体抗转移活性定位图鉴定了著名的肿瘤转移抑制基因BRMS1。在黑色素瘤、膀胱癌和非小细胞性肺癌细胞系中均发现了BRMS1肿瘤转移抑制活性[57,58]。推测BRMS蛋白介导的抑制转移机制很复杂,参与调节了细胞内多重功能(如缝隙连结的形成)和信号模块的表达(如PI3K和EGF)。
在MSG中,BRMS1是独一无二的,已证实它可调控肿瘤细胞间的缝隙连结通讯能力,因此它既调控肿瘤细胞之间的交流,也调控肿瘤细胞与周围微环境之间的交流,从而调控转移灶的生长[59]。在乳腺癌肿瘤细胞中外源表达BRMS1发现,缺氧可降低肿瘤细胞的存活——即细胞在从一个特定的表面分离后继续存活的能力(通常指组织培养瓶中二维培养模型),促进细胞凋亡,降低细胞的黏附[60]。
在许多肿瘤中,磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号通路相当重要,在调控细胞的生存和生长中起着重要作用[61,62]。PI3K磷酸化下游一个磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的磷脂,形成PIP3,然后PIP3再激活下游的效应分子如AKT等。BRMS1上调的细胞可显著降低PIP2浓度,从而抑制细胞存活和生长信号的活化。乳腺癌细胞系中BRMS1过表达也会减少表皮生长因子受体(EGFR)的表达[63,64]。EGFR是一个跨膜受体酪氨酸激酶,它在许多正常细胞中也表达,与配体结合后会引起位于胞质尾部酪氨酸残基磷酸化,通过Ras/MAPK级联反应或PI3K信号通路激活下游通路。在多种肿瘤如乳腺癌、头颈癌、结肠癌中,EGFR的下调是一个重要因素。
最后,BRMS1也被证明与调节细胞生存和凋亡的关键分子——NF-κB相互作用,同时它也能与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)复合物相互作用。而HDACs催化组蛋白去乙酰化,BRMS1和HDAC复合物能从DNA中释放出来,促进DNA转录,这也许是将来药物设计的一个可行靶标。如今尚不清楚BRMS1功能是独立的还是相互调节最终调节细胞转移潜能。
(6) RHOGDI2
RHOGDI2位于染色体12pl2.3,是通过人膀胱癌细胞系DNA芯片技术结果分析发现的[65]。Theodorescu和他的同事分析了30000多个基因,以鉴别侵袭性更高细胞系表达下调的基因。这种差异表达方法鉴定了2368个候选基因,根据相对倍数的变化筛选出其中的10个基因进行进一步研究。这10个基因中,RHOGDI2在人的样本中得到验证。将RHOGDI2导入膀胱癌细胞系,对裸鼠肿瘤原发灶的生长没有任何影响,但可显著性降低转移,符合MSG的标准。已证明RHOGDI2可抑制两个涉及侵袭的基因Rho和Rac[8]。Rac、Rho和Cdc42在细胞骨架组装、黏附和运动性方面都起重要作用。RHOGDI2的作用机制极有可能是使Rho失活,从而抑制细胞骨架再组装和运动。
利用芯片分析外源性过表达RHOGDI2的高转移膀胱癌细胞和对照之间的表达谱存在差异[66]。当细胞中上调RHOGDI2时,两种分泌性蛋白内皮素endothelin-1,(ET-1)和神经调节肽U(neuromedin U,NMu)均下调,这两种蛋白都是G蛋白偶联受体的肽激动剂。目前有一个复合物阿曲生坦(atrasentan)通过抑制ET-1受体,可显著增加转移过程中ET-1信号的作用。如今在临床试验中阿曲生坦被用来治疗癌症[67],而其他ET-1拮抗剂仍在研究当中。注射膀胱癌细胞的小鼠用阿曲生坦处理8周后,解剖发现阿曲生坦处理组的小鼠只有5%出现肺转移,但在对照组有53%的小鼠出现了肺转移。之前的一个研究表明,阿曲生坦对于病人是可以耐受的,目前正在进行针对低表达RHOGDI2膀胱癌病人的临床试验正是基于这两个实验。
(7) RKIP
激酶抑制蛋白(RKIP)最初被证明是前列腺癌的MSG,随即证明其在结肠癌和乳腺癌中也起作用[68,69]。RKIP定位在染色体12q24.23上,并表现出一系列不同功能,其功能发挥取决于其所处环境[70]。RKIP直接与RAF结合,降低MEK-ERK1/2活性,MEK-ERK1/2是在细胞生存和运动等多种细胞功能中发挥重要作用的信号通路。RKIP表达下调会导致肿瘤细胞中MAPK活化和随后的肿瘤细胞凋亡的减少[71]。在临床样本中,与配对的淋巴结转移灶相比,原发灶中RKIP表达缺失,验证了RKIP是一个MSG[68]。RKIP的表达也被认为是结肠癌患者发生转移的一个分子标记[72]。最近的研究开始阐述RKIP参与的生物学功能和信号通路[73],发现RKIP参与到多种机制,如抑制MAPK、G蛋白偶联受体激酶和NF-κB信号通路。RKIP的功能是调节这些重要的细胞转导通路,使它们维持在正确状态。推测RKIP的缺失引起关键的细胞功能如复制的异常,最终导致癌症。
(8) 新的肿瘤转移抑制基因
近年来,被称为MSG的数目大大增加。尽管对于每一个MSG的完整描述远超过了本章的范围,那些被确认的MSG列在表3-2中。尽管还没有利用转移分析方法在体内验证许多新的可能的MSG,但最近基于微阵列技术的应用,有助于发现更多的MSG。在这些可能的MSG中,有一些相当有临床应用价值,例如CD44、claudin-1和4、凝溶胶蛋白(gelsolin)、RECK和Drg-1[11]。毫无疑问,更多的MSG等待我们去发现,并满怀期望发现更多的分子靶点以转化到临床中去帮助患者。
3.2.4 临床意义
对于大部分患者而言,可能通过外科手术、放疗、化疗或者这些方法相结合来控制原发瘤在原发位点的生长。但对大部分实体瘤而言,转移或治疗并发症通常都是致命性的。尽管转移的过程很复杂,但抑制转移级联反应中的每一步都可能使整个转移过程中止。因此,在整个转移过程完成之前恢复肿瘤细胞转移抑制基因的功能在临床上是非常有用的,而转移灶克隆形成或许是转移过程中最容易干预治疗的一个环节。
但不幸的是,目前大部分肿瘤治疗实验都关注的是某一治疗药物减少患者大量转移结节的可能性。针对MSG的治疗药物期望是终止而不是逆转患者的转移进程。这些复合物极有可能不符合目前的早期临床试验的临床应用标准,有必要使用特定的临床试验来研究在佐剂条件下针对MSG治疗靶点的化合物。将来这一领域的研究是非常有前景的,因为新的技术让我们能够发现之前不能发现的转移级联反应中的某些方面。将这些研究推进到临床,像现在的Nm23和RHOGDI1一样作为潜在的治疗靶点,极有可能突破目前的临床应用领域。
(董琼珠译,钦伦秀审校)
参考文献
[1]Knudson AG Jr. Mutation and cancer: statistical study ofretinoblastoma. Proc Natl Acad Sci USA,1971,68: 820-823.
[2]Steeg PS,et al. Altered expression of NM23,a gene associatedwith low tumor metastatic potential,during adenovirus 2 Elainhibition of experimental metastasis. Cancer Res,1988,48:6550-6554.
[3]Steeg PS,et al. Evidence for a novel gene associated with lowtumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1988,80:200-204.
[4]Leone A,et al. Reduced tumor incidence,metastatic potential,and cytokine responsiveness of nm23-transfected melanoma cells.Cell,1991,65: 25-35.
[5]Leone A,et al. Transfection of human nm23-H1 into the humanMDA-MB-435 breast carcinoma cell line: effects on tumormetastatic potential, colonization and enzymatic activity.Oncogene,1993,8: 2325-2333.
[6]McNeill CA,et al. Genetic manipulation by means of microcellmediatedtransfer of normal human chromosomes into recipientmouse cells. Proc Natl Acad Sci USA,1980,77: 5394-5398.
[7]Welch DR. Technical considerations for studying cancer metastasisin vivo. Clin Exp Metastasis,1997,15: 272-306.
[8]Steeg PS. Metastasis suppressors alter the signal transduction ofcancer cells. Nat Rev Cancer,2003,3: 55-63.
[9]Steeg PS,et al. Evidence for a novel gene associated with lowtumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1988,80:200-204.
[10] Steeg P. Metastasis suppressors alter the signal transduction ofcancer cells. Nature Cancer Rev,2003,3: 55-63.
[11] Rinker-Schaeffer CW,et al. Metastasis suppressor proteins:discovery,molecular mechanisms,and clinical application. Clin Cancer Res,2006,12: 3882-3889.
[12]Parhar RS,et al. Effects of cytokine-mediated modulation of nm23expression on the invasion and metastatic behavior of B16F10melanoma cells. Int J Cancer,1995,60: 204-210.
[13] Lee HY,et al. Inhibitory activity of nm23-H1 on invasion andcolonization of human prostate carcinoma cells is not mediated byits NDP kinase activity. Cancer Lett,1999,145: 93-99.
[14] Tagashira H,et al. Reduced metastatic potential and c-mycoverexpression of colon adenocarcinoma cells ( colon 26 line )transfected with nm23-R2 /rat nucleoside diphosphate kinase alphaisoform. Int J Mol Med,1998,2: 65-68.
[15] Bhujwalla ZM,et al. Nm23-transfected MDA-MB-435 humanbreast carcinoma cells form tumors with altered phospholipidmetabolism and pH: a 3IP nuclear magnetic resonance study invivo and in vitro. Magn Reson Med,1999,41: 897-903.
[16]Miyazaki H,et al. Overexpression of Nm23-H2 /NDP kinase B ina human oral squamous cell carcinoma cell line results in reducedmetastasis,differentiated phenotype in the metastatic site,andgrowth factor-independent proliferative activity in culture. ClinCancer Res,1999,5: 4301-4307.
[17]Boissan M,et al. Increased lung metastasis in transgenic NM23-Null /SV40 mice with hepatocellular carcinoma. J Natl CancerInst,2005,97: 836-845.
[18]Lacombe ML,et al. The human Nm23 /nucleoside diphosphatekinases. J Bioenerg Biomembr,2000,32: 247-258.
[19]McDermott WG,et al. Nm23-H1 homologs suppress tumor cellmotility and anchorage independent growth. Clin Exp Metastasis,2008,25: 131-138.
[20]Hartsough MT, et al. Nm23-H1 metastasis suppressorphosphorylation of kinase suppressor of Ras via a histidine proteinkinase pathway. J Biol Chem,2002,277: 32389-32399.
[21]Aguirre-Ghiso JA,et al. ERK( MAPK) activity as a determinantof tumor growth and dormancy,regulation by p38( SAPK) . CancerRes,2003,63: 1684-1695.
[22] Aguirre-Ghiso JA,et al. Green fluorescent protein tagging ofextracellular signal-regulated kinase and p38 pathways revealsnovel dynamics of pathway activation during primary and metastaticgrowth. Cancer Res,2004,64: 7336-7345.
[23] Ranganathan AC,et al. Opposing roles of mitogenic and stresssignaling pathways in the induction of cancer dormancy. CellCycle,2006,5: 1799-1807.
[24]Steeg PS,et al. Clinical-translational approaches to the Nm23-H1metastasis suppressor. Clin Cancer Res,2008,14: 5006-5012.
[25] Horak CE,et al. Nm23-H1 suppresses tumor cell motility bydown-regulating the lysophosphatidic acid receptor EDG2. CancerRes,2007,67: 7238-7246.
[26]Horak CE,et al. Nm23-H1 suppresses metastasis by inhibitingexpression of the lysophosphatidic acid receptor EDG2. CancerRes,2007,67( 24) : 11751-11759.
[27]Ouatas T,et al. Dexamethasone and medroxyprogesterone acetateelevate Nm23-H1 metastasis suppressor gene expression inmetastatic human breast carcinoma cells: new uses for oldcompounds. Clin Cancer Res,2003,9: 3763-3772.
[28]Ohtaki T,et al. Metastasis suppressor gene Kiss-1 encodes peptideligand of a G-protein-coupled receptor. Nature,2001,411:613-617.
[29]Kotani M,et al. The metastasis suppressor gene Kiss-1 encodeskisspeptins,the natural ligands of the orphan G protein-coupledreceptor GPR54. J Biol Chem,2001,276: 34631-34636.
[30]Castellano JM,et al. Kiss-1 /kisspeptins and the metabolic controlof reproduction: physiologic roles and putative physiopathologicalimplications. Peptides,2008,30( 1) : 139-145.
[31]Nash KT,et al. Requirement of Kiss-1 secretion for multiple organmetastasis suppression and maintenance of tumor dormancy. J NatlCancer Inst,2007,99: 309-321.
[32] Ichikawa T,et al. Genetic factors and metastatic potential ofprostatic cancer. Cancer Surv,1991,11: 35-42.
[33]Takahashi M,et al. Regulation of c-Met signaling by thetetraspanin Kai-1 /CD82 affects cancer cell migration. Int JCancer,2007,121: 1919-1929.
[34]Bandyopadhyay S,et al. Interaction of Kai-1 on tumor cells withDARC on vascular endothelium leads to metastasis suppression.Nat Med,2006,12: 933-938.
[35]Prince S,et al. Tbx2 directly represses the expression of the p21( WAFl) cyclin-dependent kinase inhibitor. Cancer Res,2004,64: 1669-1674.
[36] Tsai YC,et al. The ubiqui tin ligase gp78 promotes sarcomametastasis by targeting Kai-1 for degradation. Nat Med,2007,13:1504-1509.
[37]Sridhar SC,et al. Tetraspanin Kai-1 /CD82 suppresses invasion byinhibiting integrin-dependent crosstalk with c-Met receptor and Srckinases. Oncogene,2006,25: 2367-2378.
[38]Chekmareva MA,et al. Localization of prostate cancer metastasissuppressoractivity on human chromosome 17. Prostate,1997,33:271-280.
[39]Vander Griend DJ,et al. Suppression of metastatic colonization bythe context-dependent activation of the c-Jun NH2-terminal kinasekinases JNKK1 /MKK4 and MKK7. Cancer Res,2005,65:10984-10991.
[40] Yamada SD,et al. Mitogen-activated protein kinase kinase 4( MKK4) acts as a metastasis suppressor gene in human ovariancarcinoma. Cancer Res,2002,62: 6717-6723.
[41]Hickson JA,et al. The p38 kinases MKK4 and MKK6 suppressmetastatic colonization in human ovarian carcinoma. Cancer Res,2006,66: 2264-2270.
[42] Chang L,et al. Mammalian MAP kinase signalling cascades.Nature,2001,410: 37-40.
[43] Whitmarsh AJ,et al. Role of mitogen-activated protein kinasekinase 4 in cancer. Oncogene,2007,26: 3172-3184.
[44] Teng DH,JK et al. Human mitogen-activated protein kinasekinase 4 as a candidate tumor suppressor. Cancer Res,1997,57:4177-4182.
[45] Su GH,et al. Mutation rate of MAP2K4 /MKK4 in breastcarcinoma. Human Mutation,2002,19: 81.
[46] Su GH,et al. Alterations in pancreatic,biliary,and breastcarcinomas support MKK4 as a genetically targeted tumorsuppressor gene. Cancer Res,1998,58: 2339-2342.
[47]Xin W,et al. MAP2K4 /MKK4 expression in pancreatic cancer:genetic validation of immunohistochemistiy and relationship todisease course. Clin Cancer Res,2004,10: 8516-8520.
[48] Cunningham SC,et al. MKK4 status predicts survival afterresection of gastric adenocarcinoma. Arch Surg,2006,141: 1095-1099.
[49] Stark AM,et al. Reduced metastasis-suppressor gene mRNAexpressionin breast cancer brain metastases. J Cancer Res ClinOncol,2005,131: 191-198.
[50] Kim HL,et al. Mitogen-activated protein kinase kinase 4metastasis suppressor gene expression is inversely related tohistological pattern in advancing human prostatic cancers. CancerRes,2001,61: 2833-2837.
[51] Kennedy NJ,et al. Role of JNK in tumor development. CellCycle,2003,2: 199-201.
[52]Wang L,et al. Evidence of MKK4 pro-oncogenic activity in breastand pancreatic tumors. Oncogene,2004,7: 7.
[53]Cunningham SC,et al. Targeted deletion of MKK4 in cancer cells:a detrimental phenotype manifests as decreased experimentalmetastasis and suggests a counterweight to the evolution of tumorsuppressorloss. Cancer Res,2006,66: 5560-5564.
[54] Lotan TL,et al. Up-regulation of MKK4,MKK6 and MKK7during prostate cancer progression: an important role for SAPKsignalling in prostatic neoplasia. Pothologg,2007,212: 386-394.
[55]Lotan T,et al. JNKK1 /MKK4 mediated inhibition of SKOV3ip. lovarian cancer metastasis involves growth arrest and p21upregulation. Cancer Res,2008,68( 7) : 2166-2175.
[56]Seraj MJ,et al. Functional evidence for a novel human breastcarcinoma metastasis suppressor,BRMS1,encoded at chromosome1 lql3. Cancer Res,2000,60: 2764-2769.
[57]Shevde LA,et al. Suppression of human melanoma metastasis bythe metastasis suppressor gene,BRMS1. Exp Cell Res,2002,273: 229-239.
[58]Seraj MJ,et al. The relationship of BRMS1 and RhoGDI2 geneexpression to metastatic potential in lineage related human bladdercancer cell lines. Clin Exp Metastasis,2000,18: 519-525.
[59]Saunders MM,et al. Breast cancer metastatic potential correlateswith a breakdown in homospecific and heterospecific gap junctionalintercellular communication. Cancer Res,2001,61: 1765-1767.
[60]Hedley BD,et al. BRMS1 suppresses breast cancer metastasis inmultiple experimental models of metastasis by reducing solitary cellsurvival and inhibiting growth initiation. Clin Exp Metastasis,2008,25( 7) : 727-740.
[61]DeWald DB,et al. Metastasis suppression by breast cancermetastasis suppressor 1 involves reduction of phosphoinositidesignaling in MDA-MB-435 breast carcinoma cells. Cancer Res,2005,65: 713-717.
[62]Zhang S,et al. Suppression of human ovarian carcinoma metastasisby the metastasis-suppressor gene,BRMS1. Int J Gynecol Cancer,2006,16: 522-531.
[63] Vaidya KS, et al. Breast cancer metastasis suppressor-1differentially modulates growth factor signaling. J Biol Chem,2008,283: 28354-28360.
[64] Hurst DR,et al. Alterations of BRMS1-ARID4A interactionmodify gene expression but still suppress metastasis in humanbreast cancer cells. J Biol Chem,2008,283: 7438-7444.
[65]Gildea JJ,et al. RhoGDI2 is an invasion and metastasis suppressorgene in human cancer. Cancer Res,2002,62: 6418-6423.
[66]Titus B,et al. Endothelin axis is a target of the lung metastasissuppressor gene RhoGDI2. Cancer Res,2005,65: 7320-7327.
[67]Chiappori AA,et al. Phase I /II study of atrasentan,an endothelinA receptor antagonist, in combination with paclitaxel andcarboplatin as first-line therapy in advanced non-small cell lungcancer. Clin Cancer Res,2008,14: 1464-1469.
[68] Hagan S,et al. Reduction of Raf-1 kinase inhibitor proteinexpression correlates with breast cancer metastasis. Clin CancerRes,2005,11: 7392-7397.
[69]Fu Z,et al. Effects of raf kinase inhibitor protein expression onsuppression of prostate cancer metastasis. J Natl Cancer Inst,2003,95: 878-889.
[70] Keller ET. Metastasis suppressor genes: a role for raf kinaseinhibitor protein ( RKIP) . Anticancer Drugs,2004,15: 663-669.
[71]Chatterjee D,et al. RKIP sensitizes prostate and breast cancercells to drug-induced apoptosis. Biol Chem, 2004, 279:17515-17523.
[72]Zlobec I,et al. Node-negative colorectal cancer at high risk ofdistant metastasis identified by combined analysis of lymph nodestatus,vascular invasion,and Raf-1 kinase inhibitor proteinexpression. Clin Cancer Res,2008,14: 143-148.
[73]Granovsky AE,et al. Raf kinase inhibitory protein: a signaltransduction modulator and metastasis suppressor. Cell Res,2008,18: 452-457.
[74]Iizumi M,et al. Interaction of Duffy antigen receptor forchemokines and Kail: a critical step in metastasis suppression.Cancer Res,2007,67: 1411-1414.
[75]Eves EM,et al. Raf kinase inhibitory protein regulates aurora Bkinase and the spindle checkpoint. Mol Cell,2006,23: 561-574.
[76]Fu Z,et al. Effects of raf kinase inhibitor protein expression onsuppression of prostate cancer metastasis. J Natl Cancer Inst,2003,95: 878-889.
[77]Schuierer MM,et al. Reduction in Raf kinase inhibitor proteinexpression is associated with increased Ras-extracellular signalregulatedkinase signaling in melanoma cell lines. Cancer Res,2004,64: 5186-5192.
[78]Rodrigues S,et al. Opposing roles of netrin-1 and the dependencereceptor DCC in cancer cell invasion, tumor growth andmetastasis. Oncogene,2007,26: 5615-5625.
[79]Stupack DG,et al. Potentiation of neuroblastoma metastasis byloss of caspase-8. Nature,2006,439: 95-99.
[80]Fujita H,et al. Gelsolin functions as a metastasis suppressor inB16-BL6 mouse melanoma cells and requirement of the carboxylterminusfor its effect. Int J Cancer,2001,93: 773-780.
[81]Kippenberger S,et al. Restoration of E-cadherin sensitizes humanmelanoma cells for apoptosis. Melanoma Res,2006,16: 393-403.
[82]Michl P,et al. Claudin-4 expression decreases invasiveness andmetastatic potential of pancreatic cancer. Cancer Res,2003,63:6265-6271.
[83]Gao AC,et al. CD44 is a metastasis suppressor gene for prostaticcancer located on human chromosome 11p13. Cancer Res,1997,57: 846-849.
[84]Gao AC,et al. Metastasis suppression by the standard CD44isoform does not require the binding of prostate cancer cells tohyaluronate. Cancer Res,1998,58: 2350-2352.
[85]Sato S,et al. Upregulated CD44v9 expression inhibits the invasionof oral squamous cell carcinoma cells. Pathobiology,2004,71:171-175.
[86]Sato S,et al. Inhibition of CD44v9 upregulates the invasion abilityof oral squamous cell carcinoma cells. Oral Oncol,2003,39:27-30.
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