种系变异及其他

◎Nigel P. S. Crawford，Kent W. Hunter

3.5.1 转移进展的传统模式

长期以来体细胞突变理论被视为在分子水平上解释转移的传统模式。Nowell最初提出这个假设［1］，认为转移性肿瘤细胞通过一系列体细胞突变的连续积累，获得利于其在远处定植和增殖所必需的特性。后来Fidler和Kripke提供了支持这一理论的实验依据［2］，证明从肿瘤组织中分离的不同克隆具有不同的转移潜能。据推测，转移能力的差异来源于不同克隆的不同体细胞突变。随后的工作证明，这些体细胞突变可诱发促转移基因的过度活化和转移抑制基因的沉默，个别肿瘤细胞由于其内在的“基因组不稳定性”而易于发生这些突变的累积［3］。

然而，随后的体内实验发现，虽然体细胞变异可能是影响转移潜能的关键因素之一，但其不能完美地解释转移的分子基础［4-6］。用以检测整体基因表达模式的芯片技术的出现，为解决体细胞进化理论的局限性带来了一丝曙光，由此可以更全面地理解其分子机制［7］。尤其是许多研究表明，肿瘤组织的基因表达谱(或“标签”)可以用来预测乳腺癌［8-10］以及许多其他实体瘤［7］患者的生存。事实上，这些芯片研究大多使用在临床转移发生前收集的原发肿瘤组织。这似乎与体细胞进化论不符。由于绝大多数肿瘤相关的死亡是由转移造成的，可预测生存的基因表达标签为何在临床可见的转移发生之前就已存在?

这个问题有很多可能的答案，其中最可能的就是在某些个体中已经存在临床上检测不到的转移，其在诊断时被认为是“转移前期”。另一种解释为，在肿瘤发生后迅速出现体细胞突变(“奠基”突变)，并将突变传递给连续几代的肿瘤细胞，从而诱发预后相关基因表达标签［8，11］。毫无疑问，这是一个很诱人的假说，不仅明确了为何预后相关基因表达标签存在于早期肿瘤中，还为原发癌未知(UPC)转移性疾病的存在提供了解释。UPC转移性疾病是指病人具有明显的转移瘤，但没有临床可见的原发瘤或仅有分化良好的微小病变。该类型疾病约占新诊断肿瘤病例的5%［12］，因为小肿瘤应该没有足够的时间来产生必要的转移突变，所以似乎与体细胞突变理论不符。但是，如果转移潜能的获得是肿瘤发生过程中的早期事件，就不难理解小部分肿瘤可以发生早期转移，从而产生UPC转移性疾病现象。

3.5.2 种系编码转移易感性的概念

另一种与其互相补充的假说认为，个体间转移潜能和肿瘤基因表达标签的差异，受宿主种系变异的影响。也就是说，任何特定的个体在转移潜能方面都是“硬连接”，转移潜能是转移“易感”基因遗传变异的结果，并且在一定程度上，转移潜能在肿瘤发生之前即已确定。从表面上看，这种说法与传统的转移机制相比似乎有点古怪。但对该观点的进一步思考揭示了这样一种可能，即种系编码(germline-encoded)转移易感性补充了传统理论。任何实体瘤的自然演变最可能依赖于体细胞突变的连续积累，而单个肿瘤细胞的固有转移能力主要取决于这些突变。然而，宿主种系变异可能不仅影响肿瘤细胞的内在属性，还影响在原发和转移部位与之相互作用的其他组织的性质。因此，从肿瘤发生的起始到转移肿瘤细胞在转移位点的增殖，所有这些步骤都有可能被宿主种系变异所影响(图3-9)。

图3-9 转移潜能的种系调节

注: 最近的研究表明，转移潜能是由宿主种系多态性调节的。用基因芯片对来自近交系小鼠的正常、非癌乳腺组织的基因表达模式进行分析表明，转移倾向的“编程”发生在肿瘤发生之前［33］。这些差异表达可能是由多个转移易感基因多态性的联合作用所致。因此，即使在肿瘤发展之前，由于这些多态性基因的影响，任何特定的个体对发生转移都将具有不同的易感性(1)。不过，这些转移易感基因不可能影响肿瘤的起始，肿瘤随后通过体细胞进化发展而来(2)。转移易感基因的临床影响可能要在原发瘤发展后才会最显著地表现出来，可能对原发瘤内基因表达产生影响，并在转移“许可”基因型个体中诱导产生预后不良的表达标签(3)。最后，转移的整体可能性将受到转移易感基因的影响，其不仅作用于原发瘤组织，而且作用于继发性肿瘤的植入位点和其他相互作用的组织(4)。

许多研究表明种系变异与乳腺癌易感性有关，包括多个低外显率等位基因调变易损性［13］。最具特征性的乳腺癌易感基因是BRCA-1和BRCA-2，其特定的种系突变与各项预示预后较差的指标相关［14-17］。由于遗传变异影响乳腺癌易感性，在发生原发肿瘤后，类似的种系变异完全可能使某些个体更容易发生转移。流行病学研究支持这一观点， Hartman等最近的一项研究表明，直系亲属在确诊为乳腺癌后5年内死亡的病人，乳腺癌整体存活率显著降低［18］。

此外，不同种族的肿瘤预后也各不相同。在美国，白种人女性的乳腺癌年龄标化死亡率是28.3/10万，而黑种人女性是36.4/10万［19］。最近的一个深入的流行病学研究表明，基底细胞样乳腺肿瘤在美国绝经前黑种人女性中发病率较高［20］。这些研究表明，不同种族的多态性位点可能在诱导疾病发生易感性和进展快慢方面发挥作用。然而，肿瘤发展种族差异的起源可能是极其复杂的，除了种系基因多态性之外，包括环境风险、可获得卫生保健设施的差异等其他因素可能也发挥同等重要的作用。

3.5.3 小鼠模型和种系编码转移易感性

虽然这是一个有趣的假设，但什么证据能够支持种系编码变异可影响转移潜能? 最引人注目的数据来自小鼠的乳腺肿瘤模型，这早已被证明是研究肿瘤易感性的有用工具［21，22］。这些模型的价值在于能够控制混淆人群疾病易感性的变量，即遗传变异和环境暴露。具体来说，在一般人群中低外显率(大多未知)肿瘤易感基因的分布差异和环境暴露(如致癌物质)的不同水平，都可阻碍研究人员对肿瘤易感基因的确定［23］。

(1) Py MT小鼠是确定调节转移潜能遗传因素的工具

Py MT小鼠是一种表达多瘤病毒中等T抗原的转基因模型，该抗原的表达受乳腺特异性小鼠乳腺肿瘤病毒启动子［FVB/N-TGN(MMTV-Py MT)634Mul］的控制。其已被证明在研究乳腺肿瘤形成中特别有效，因为100%的小鼠在60日龄左右发展出高侵袭性、高转移性的肿瘤，85%～95%的小鼠在100日龄时形成明显的肺转移灶［24］。研究种系基因多态性对转移潜能影响的方法为:用雄性Py MT小鼠与各种不同的自交系实验室品系雌性小鼠繁殖后代，并对F1子代的转移潜能进行定量。据观察，F1小鼠具有变化范围很大的转移效率，与野生型Py MT小鼠相比，肺转移效率的变化范围可从降至1/10到增加3倍［25］。值得注意的是，所有F1子代在育种中都获得了Py MT转基因。因此，所有动物在相同的基因组位点中整合进了相同数量的转基因拷贝，所有肿瘤都由同一致癌事件起始(即Py MT抗原)。鉴于这些事实，似乎能够明确在F1子代中观察到的转移潜能差异是由亲代种系之间的种系变异所引起。因此可得出结论:不同的自交系实验性小鼠可能携带多个调节转移效率的多态性位点。

(2) Py MT小鼠定量性状基因位点图谱的绘制

定量性状基因位点(QTL)图谱的绘制，是为了明确单个基因位点对不同品系小鼠转移易感性差异的影响。简而言之，QTL或易感基因位点就是包含大量多态性基因的连续基因组区域，其中的一个或多个负责调控对某一性状的易感性。确定它们的方法是，通过在既定人群中将可测量的性状(如转移负荷)与多态性遗传标记［如微卫星标记或单核苷酸多态性(SNP)］的等位基因变异进行关联。

确认转移相关QTL的基因图谱绘制实验是将Py MT小鼠与不同转移潜能的近交系小鼠杂交，随后进行一系列的回交。初步结果发现，染色体6和19上存在两个转移易感基因位点［26］，随后的研究发现染色体7、9和17上的位点［27］。其中，最先被详细研究的是位于19号染色体近端命名为Mtes1的基因位点［26］。对Mtes1的分析利用不同近交系之间共享的单倍体，使用了一种称为“多重交叉映射”(multiple cross mapping)的实验方法［28］。由此成功绘制小鼠19号染色体上约10Mbp的中等分辨率Mtes1基因位点图谱。随后从高转移潜能的近交系中识别共同的单倍体组，使这些位点上合理的候选基因数量从大约500个收窄至23个［29］。第一个转移易感基因是结合多种实验研究方法被确定的，包括根据分子功能或与已知转移进程相联系的分类、确定已知多态性是否与潜在功能具有相关性的DNA序列分析，以及遗传相关重复串联序列变异的分离分析［30］。该基因被命名为信号诱导的增殖相关基因1(Sipa1，也称为Spa1)，编码的蛋白质含有一个C端的亮氨酸拉链基序和一个N端的与人类RAP1GAP同源的GTP酶激活蛋白(GAP)结构域(将在后面进行更详细的讨论)。

(3) Py MT诱导的乳腺肿瘤和正常乳腺组织的基因芯片分析

如前所述，易转移的人类原发性乳腺肿瘤表达特征性的基因标签［8-10］。因此，可以推论在易转移小鼠的Py MT诱导肿瘤中也应该存在类似的基因表达标签。实际情况正是如此，人类乳腺癌原发瘤［8-10］与不同遗传背景下Py MT诱导的乳腺癌［31，32］之间具有高度的相关性。

由此产生的一个相关问题是，这些不同转移潜能小鼠的乳腺肿瘤基因表达标签除了受体细胞突变模式差异的影响，是否也受种系特异性种系多态性的影响。如果种系多态性不仅参与诱发这些基因表达标签，还整体参与到转移进程中，那么应该得出推论:来源于不同转移倾向小鼠的正常、非肿瘤组织应包含乳腺肿瘤中的特征性基因标签。为了验证该假设，对来源于Py MT小鼠与不同转移能力小鼠F1后代的正常乳腺组织基因表达模式进行了研究［33］。由于研究的是遗传多态性的独立作用，而不是Py MT抗原的作用，所以仅描述了转基因阴性的F1小鼠基因表达标签。应用实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测Ramaswamy等人［8］报道的人类乳腺癌基因表达标签的各个组分。结果发现转移预测标签的17个基因中有10个基因的表达水平可以用来对来源于不同转移潜能基因型小鼠的正常乳腺组织样本准确地进行分类［33］。

这些研究证实了种系多态性可调节转移潜能假说，即基因表达中可预测转移的相关改变先于肿瘤发生。为了证实这一结果，对来自AKXD重组自交(RI)系［34］培育的Py MT小鼠［33］进行基因芯片表达研究。RI种系非常适合于复杂的、非孟德尔遗传性状，如转移易感性研究的特殊品种近交系小鼠。它们的培育特点为，含有两个亲代近交系独特的、比例大致相等的遗传贡献。在AKXDRI小鼠的例子中，亲代种系分别为高转移潜能的AKR/J种系和低转移潜能的DBA/2J种系［34］。RI种系的构建即通常的使两个近交系杂交产生F1代，随后进行连续20代或更多代的兄妹交配［35］。在获得AKXDx Py MT基因表达标签后，对来自高和低转移潜能转基因阴性F1小鼠的正常乳腺组织进行标签基因表达的定量。与人类标签基因的情况相同，AKXDxPyMT基因标签表达特征的变化存在于不同转移能力种系［33］。此外，这些基因表达的差异可以用来准确区分来源于不同转移潜能小鼠的组织。

因此，在肿瘤发生之前，在正常组织中就已产生基因表达变化，这些基因在转移中通常是失调的。鉴于其他混杂变量，如环境暴露在实验室小鼠中受到严格控制，所观察到的基因表达差异最合理的解释是，它们由种系特异性种系变异所决定。这些发现，以及与转移QTL相关的发现都有力地表明转移的易感性在一定程度上是一种遗传性状。不过，为了进一步了解种系编码转移易感性的起源，有必要探讨单个多态性基因对差异性转移倾向的作用。在下一节中，我们将讨论单个转移易感基因，并介绍它们是如何被发现的。

3.5.4 转移易感基因

(1) Sipa1——最初的转移易感基因

如前所述，多方面研究促进了第一个转移易感基因Sipa1的发现［30］。Sipa1编码RAP1和RAP2特异性GAP。这两个因子都是GTP酶Ras家族成员，参与调控细胞增殖、分化和黏附［36］。同时，Sipa1在调节细胞黏附方面发挥重要作用，在Hela细胞中瞬时表达Sipa1可诱导细胞聚集并脱离培养皿的表面［37］。Sipa1可能是通过调节各种细胞黏附分子来调节细胞黏附的，它们可以破坏细胞与细胞外基质蛋白及其他黏附关键因子的相互作用［38-40］。该调节作用的核心是对整合素分子的调控，Sipa1的RAP1GAP活性是这方面的关键［39］。

虽然细胞黏附失调已被证明是转移进程的重要组成部分，但Sipa1在转移中的具体作用机制尚未明确。不过，最近的一项研究强调了Sipa1在种系编码转移易感性中的重要性［41］。在这项研究中，选取了加州南部一个病例信息完整的非西班牙裔白种人乳腺癌患者群体，并检测其Sipa1基因的单核苷酸多态性频率。发现乳腺癌患者Sipa1内特定的等位基因多态性与不良预后标记存在关联，其中最重要的是某些Sipa1SNP与远处转移发生率较高密切相关［41］。这是个特别重要的发现，因为它将种系编码转移易感性的概念，从原先仅在小鼠中观察到的现象带到人类转移发展的领域。其潜在的临床意义以及与其他转移易感基因类似的观察结果，将在随后进行讨论。

(2) 细胞外基质基因表达的种系编码修饰物

如前所述，已证明对肿瘤基因表达模式的QTL图谱绘制和微阵列分析是确定种系元件调节转移潜能的特别有用的方法。最近的一些研究综合利用这些方法发现新的转移易感基因［42-44］。所有这些研究都源于一个观察结果:细胞外基质(ECM)基因同时存在于人类乳腺癌［8-10］和小鼠乳腺肿瘤［45］的转移预测基因表达标签中。这意味着，ECM基因失调可能是转移潜能的诱发因素或标志。

早期的芯片研究表明，小鼠乳腺肿瘤的基因表达受宿主种系变异的影响［33，45］。为了确定在不同转移潜能的肿瘤中观察到的ECM基因表达水平是否也受种系变异的影响，进行了一项QTL表达(e QTL)图谱绘制的实验［43，44］。在实验中，对肿瘤的整体基因表达模式进行量化，选取的肿瘤来源于AKXD RI小鼠与Py MT小鼠杂交获得的F1子代。ECMe QTL(即控制ECM基因表达的基因组位点，这些ECM基因在早期乳腺癌基因表达标签中被发现)的确定需要使用GeneNetwork中的Web QTL数据库，GeneNetwork是基于互联网的能够进行RI微阵列表达数据分析的分析性数据包(库)［46，47］。ECM eQTL后来在第7、17和18号染色体上被发现，这意味着这些基因组区域在转移预测ECM基因表达的调节中发挥潜在的重要作用。有趣的是，在7和17号染色体上ECMe QTL的基因位点与先前所述的转移易感基因位点是共同定位的［27］，从而进一步支持了ECM基因的差异表达是转移易感性的标记之一的假说。

为了识别3个ECMe QTL中的各自独立候选基因，使用Web QTL性状相关功能对基因芯片数据进行了全基因组相关性分析［47］。这样做的目的是识别ECMe QTL区间中的候选基因，在整个AKXDRI组中这些基因的表达与转移预测ECM基因的表达高度相关。这推动了7个很有研究价值的候选基因的确定，在AKXDRI小鼠中它们的表达与转移预测ECM基因表现出高度相关性［42-44］。其中两个最有价值的候选基因即Rrp1b和Brd4，将在下面的章节中进一步地详细讨论。

(3) Rrplb作为ECMe QTL和转移易感候选基因

经过并行和独立的实验研究［44］，功能未知基因Rrp1b被确定为潜在的转移易感候选基因。首先，使用前面提到的方法，其在物理上被确定为一个位于17号染色体ECM e QTL联动高峰区域的基因。此外，从这些e QTL测绘实验中获得的芯片数据表明，Rrp1b的表达水平与转移预测ECM基因的表达水平高度相关。Rrp1b在看似无关的第二系列酵母双杂交实验中也被识别，该实验被用来确定与先前所描述的转移效率调节剂Sipa1相互作用的因子。免疫共沉淀不仅证实了这种相互作用，也证明Sipa1酶解RAP1GAP的活性因这种相互作用而降低。

为了进一步研究该基因在ECM基因的表达以及调节转移潜能方面的作用，在多个小鼠细胞系中异位表达Rrp1b［44］。与ECMe QTL测绘实验的结果一样，过度激活Rrp1b诱导多个转移预测ECM基因表达的失调。此外，从高转移性Mvt-1小鼠乳腺肿瘤细胞系中分离Rrp1b表达克隆株并植入小鼠，可证明Rrp1b能够抑制肿瘤的生长和肺转移。

Rrp1b似乎也在人类种系水平对肿瘤进展发挥调节作用。具体来说，由芯片分析Mvt-1细胞系中Rrp1b异位表达诱导的基因表达标签，可以在一个资料完善的人类乳腺癌基因芯片库中准确地预测生存［44］。为了确认Rrp1b在种系编码转移易感性中的重要性，在两个分别来自南加州和马里兰州的乳腺癌群体中检测人类Rrp1b基因上一个非同义编码多态性出现的频率［44］。这些研究证明Rrp1b SNP位点的变异与较低的远处转移发生率和更高的整体生存可能性有关。Rrp1b在生殖细胞水平调节转移潜能的确切机制目前尚不清楚，不过它与Sipa1的相互作用以及对ECM成分的调节可能是其中的关键(图3-10)。

(4) Brd4作为ECMe QTL和转移易感性候选基因

研究相对深入的溴蛋白Brd4，是一种转录调节剂和有力的细胞生长调节剂［48，49］。Brd4的作用之一是促进G2/M期的转换［48］，该作用依赖于Brd4与其结合物，即前面所描述的种系编码转移效率调节剂Sipa1在细胞内的平衡［50］。

与Rrp1b一样，Brd4也是一个ECMe QTL候选基因，其定位与Rrp1b和17号染色体e QTL连锁峰区域非常接近［42，43］。Brd4在AKXDx Py MT乳腺肿瘤中的表达水平也与EMC转移预测基因的表达水平高度相关。最后，在高转移性Mvt-1细胞系中该基因的异位表达不仅可调节ECM基因的表达，而且可抑制乳腺脂肪垫植入后肿瘤的生长和转移［42］。然而，最重要的是，对异位表达Brd4的Mvt-1细胞进行芯片分析表明，Brd4诱导的基因表达标签可以用来在5个乳腺癌基因芯片库中准确预测生存［42］。此外，同样的标签可以用来对雌激素受体(ER)阳性和淋巴结(LN)转移阴性的乳腺癌(传统观点认为复发风险低)患者进行进一步分类，以确定原发肿瘤切除后复发风险较高的个体。

3.5.5 调控转移易感性的其他因素

众所周知，环境因素的暴露如香烟烟雾和乙醇会增加多种癌症的易感性。但这些因素也能调节转移潜能吗? 事实确实如此，最近一项使用Py MT小鼠的研究表明，高脂肪饮食会增加肺转移的发生率［51］。此外，该实验证明这些饮食因素与转移易感基因位点之间存在相互作用。这类研究说明在小鼠中除了准确模拟人类癌症特点外，模拟人群环境暴露特点也是非常重要的。

转移易感性的另一个影响因素是免疫力。例如，长期以来，人们一直怀疑原发肿瘤的手术切除会促进已经存在的微小转移和播散肿瘤细胞在围手术期的生长［52］。这其中可能的机制被一一列举，其中之一涉及重大手术时抑制细胞免疫(CMI)的做法［53，54］。以往的研究表明，自然杀伤细胞(NK细胞)是CMI介导的循环肿瘤细胞和微转移调控的重要组成部分。对于药物对免疫系统的干预来说，这可能是一个有趣的概念。例如在啮齿类动物模型中，围手术期使用COX-2抑制剂和β受体阻滞剂，可造成手术后NK细胞活性的降低［56］，这个令人感兴趣的结果可以证明NK细胞的作用在转移中的重要性［55］。但尚需进一步研究以确定这些研究结果与人类疾病的相关性。

图3-10 Rrp1b、Sipa1、ECM和转移

注: 转移易感基因Rrp1b和Sipa1的关系可能是种系调控转移潜能中的一个重要元件，虽然它们之间错综复杂的关系目前尚不清楚。已知Rrp1b直接作用于Sipa1，并凭借这种作用降低Sipa1的Rap GAP酶解活性。Rrp1b也可调节ECM基因的表达，这些基因在许多预测转移的基因芯片表达标签中失调，意味着这些标签可能部分由种系驱动。可以肯定的是，这种种系驱动的差异性ECM基因表达可创造容许原发肿瘤细胞(已通过体细胞进化出现)完成转移级联反应的环境。实际情况是否确如所述，目前正在研究中。

3.5.6 结论与临床观点

乳腺肿瘤的小鼠模型表明，种系多态性在转移潜能的调节方面发挥着重要作用。Py MT小鼠乳腺肿瘤模型已成功地用于确定转移的易感基因位点，其中包括不同转移能力近交系小鼠的修饰基因［26，27，29］。进一步的分析确认了种系编码的转移易感基因，并发现其中最具有研究价值的3个:Sipa1、Rrp1b和Brd4［30，42，44］。这些基因并不仅对小鼠的转移易感性产生影响，还被证明在人类乳腺癌转移中都是种系编码调节剂。在体外激活Rrp1b和Brd4可诱导能在多个人类乳腺癌群体中准确预测生存的基因表达标签［42，44］。此外，流行病学相关研究已经确定，携带变异SNP等位基因的人类 Sipa1 和 Rrp1b 多态性对转移具有不同的易感性［41，44］。

利用现有的临床步骤和疾病特征如肿瘤分级、分期，以及各种原发肿瘤细胞表面标记的表达来对预后进行评估有些不精确。而基于芯片的肿瘤基因表达谱具有在诊断及对预后进行预测的能力，这在完善临床医生能力方面具有很大潜力。目前一些评估肿瘤基因表达谱作为预后预测工具实用性的临床试验正在进行 ( 例如，TAILORx、MINDACT［57］)。然而，肿瘤基因表达谱受到一些限制，例如对表达模式的评估需要获得原发肿瘤组织。此外，许多报道显示了实验室与实验室之间在芯片数据上的差异［58］。基于肿瘤基因表达模式的预后分析，必须证明它们可以克服这些问题并具有真正的临床价值。

同时，在乳腺癌预后的评估方面，生殖细胞成分对转移潜能调节的影响特别让人感兴趣。鉴于转移易感基因多态性在所有组织中都存在，可想而知，肿瘤进展风险的评估可以通过检测易于获得的组织如血液中的多态性来进行。一般来说，与检测肿瘤基因表达相比，SNP分型会产生更少的歧义。因此，与分析肿瘤基因表达模式相比，对转移易感基因如Sipa1［41］和Rrp1b［44］进行生殖细胞多态性分型在预后评估方面更具优势。具体来说，SNP基因分型采用更易获得的组织、产生更明确的结果，并且操作费用相对低廉。

使用生殖细胞多态性评估预后的主要缺点是，单个SNP的预测价值较低。然而，在多个转移易感基因中对一组多态性进行检测，可以获得具有临床应用价值的足够预测能力。当然，这就必须鉴定出人群中具有多态性的新转移易感基因。因此，对种系编码转移易感基因多态性的评估在临床上是否有用，将在今后的工作中进一步探讨。

(魏金旺译，钦伦秀审校)

参考文献

［1］Nowell PC. The clonal evolution of tumor cell populations.Science，1976，194: 23-28.

［2］Fidler IJ，et al. Metastasis results from preexisting variant cellswithin a malignant tumor. Science，1977，197: 893-895.

［3］Boland CR，Goel A. Somatic evolution of cancer cells. SeminCancer Biol，2005，15: 436-450.

［4］Giavazzi R，et al. Metastasizing capacity of tumour cells fromspontaneous metastases of transplanted murine tumours. Br JCancer，1980，42: 462-472.

［5］Mantovani A，et al. Characterization of tumor lines derived fromspontaneous. metastases of a transplanted murine sarcoma. Eur JCancer，1981，17: 71-76.

［6］Milas L，et al. Spontaneous metastasis: random or selective? ClinExp Metastasis，1983，1: 309-315.

［7］Weigelt B，et al. Breast cancer metastasis: markers and models.Nat Rev Cancer，2005，5: 591-602.

［8］Ramaswamy S，et al. A molecular signature of metastasis inprimary solid tumors. Nat Genet，2003，33: 49-54.

［9］van't Veer LJ，et al. Gene expression profiling predicts clinicaloutcome of breast cancer. Nature，2002，415: 530-536.

［10］van de Vijver MJ，et al. A gene-expression signature as a predictorof survival in breast cancer. N Engl J Med，2002，347:1999-2009.

［11］Bernards R， et al. A progression puzzle. Nature， 2002，418: 823.

［12］Riethmuller G，et al. Early cancer cell dissemination and latemetastatic relapse: clinical reflections and biological approaches tothe dormancy problem in patients. Semin Cancer Biol，2001，11:307-311.

［13］Houlston RS， et al. The search for low-penetrance cancersusceptibility alleles. Oncogene，2004，23: 6471-6476.

［14］Foulkes WD，et al. Germ-line BRCA1 mutation is an adverseprognostic factor in Ashke-nazi Jewish women with breast cancer.Clin Cancer Res，1997，3: 2465-2469.

［15］Stoppa-Lyonnet D，et al. Familial invasive breast cancers: worseoutcome related to BRCA1 mutations. J Clin Oncol，2000，18:4053-4059.

［16］Goode EL，et al. Effect of germ-line genetic variation on breastcancer survival in a population-based study. Cancer Res，2002，62: 3052-3057.

［17］Robson ME，et al. A combined analysis of outcome followingbreast cancer: differences in survival based on BRCA1 /BRCA2mutation status and administration of adjuvant treatment. BreastCancer Res，2004，6: R8-R17.

［18］Hartman M，et al. Is breast cancer prognosis inherited? BreastCancer Res，2007，9: R39.

［19］Porter PL，et al. Racial differences in the expression of cell cycleregulatoryproteins in breast carcinoma. Cancer，2004，100: 2533-2542.

［20］Carey LA，et al. Race，breast cancer subtypes，and survival inthe Carolina Breast Cancer Study. JAMA，2006，295: 2492-2502.

［21］Demant P. Cancer susceptibility in the mouse: genetics，biologyand implications for human cancer. Nat Rev Genet，2003，4: 721-734.

［22］Szpirer C，et al. Mammary cancer susceptibility: human genes androdent models. Mamm Genome，2007，18: 817-831.

［23］Hunter KW，et al. Complexities of cancer research: mouse geneticmodels. ILAR J，2002，43: 80-88.

［24］Guy CT，et al. Induction of mammary tumors by expression ofpolyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model formetastatic disease. Mol Cell Biol，1992，12: 954-961.

［25］Lifsted T，et al. Identification of inbred mouse strains harboringgenetic modifiers of mammary tumor age of onset and metastaticprogression. Int J Cancer，1998，77: 640-644.

［26］Hunter KW，et al. Predisposition to efficient mammary tumormetastatic progression is linked to the breast cancer metastasissuppressor gene Brms1. Cancer Res，2001，61: 8866-8872.

［27］Lancaster M，et al. Modifiers of mammary tumor progression andmetastasis on mouse chromosomes 7，9，and 17. Mamm Genome，2005，16: 120-126.

［28］Hitzemann R，et al. Multiple cross mapping ( MCM) markedlyimproves the localization of a QTL for ethanol-induced activation.Genes Brain Behav，2002，1: 214-222.

［29］Park YG，et al. Multiple cross and inbred strain haplotypemapping of complex-trait candidate genes. Genome Res，2003，13: 118-121.

［30］Park YG，et al. Sipal is a candidate for underlying the metastasisefficiency modifier locus Mtes1. Nat Genet， 2005， 37:1055-1062.

［31］Hunter KW. Allelic diversity in the host genetic background maybe an important determinant in tumor metastatic dissemination.Cancer Lett，2003，200: 97-105.

［32］Qiu TH，et al. Global expression profiling identifies signatures oftumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation tohuman disease. Cancer Res，2004，64: 5973-5981.

［33］Yang H，et al. Metastasis predictive signature profiles pre-exist innormal tissues. Clin Exp Metastasis，2005，22: 593-603.

［34］Mucenski ML，et al. AKXD recombinant inbred strains: modelsfor studying the molecular genetic basis of murine lymphomas. MolCell Biol，1986，6: 4236-4243.

［35］Bailey DW. Recombinant-inbred strains. An aid to findingidentity，linkage，and function of histocompatibility and othergenes. Transplantation，1971，11: 325-327.

［36］Kurachi H， et al. Human SPA-1 gene product selectivelyexpressed in lymphoid tissues is a specific GTPase-activatingprotein for Rapl and Rap2. Segregate expression profiles from arap1 GAP gene product. J Biol Chem，1997，272: 28081-28088.

［37］Tsukamoto N， et al. Rapl GTPase-activating protein SPA-1negatively regulates cell adhesion. J Biol Chem，1999，274:18463-18469.

［38］Liu L，et al. The GTPase Rap 1 regulates phorbol 12-myristate 13-acetate-stimulated but not ligand-induced beta 1 integrindependentleukocyte adhesion. J Biol Chem， 2002， 277:40893-40900.

［39］Su L，et al. AF-6 controls integrin-mediated cell adhesion byregulating Rap1 activation through the specific recruitment of Rap1GTP and SPA-1. J Biol Chem，2003，278: 15232-15238.

［40］Shimonaka M，et al. Rap 1 translates chemokine signals tointegrin activation，cell polarization，and motility across vascularendothelium under flow. J Cell Biol，2003，161: 417-27.

［41］Crawford NP，et al. Polymorphisms of SIPA1 are associated withmetastasis and other indicators of poor prognosis in breast cancer.Breast Cancer Res，2006，8: R16.

［42］Crawford NP，et al. Bromodomain 4 activation predicts breastcancer survival. Proc Natl Acad Sci USA， 2008， 105:6380-6385.

［43］Crawford NP，et al. The dias-porin pathway: a tumor progressionrelatedtranscriptional network that predicts breast cancer survival.Clin Exp Metastasis，2008，25: 357-369.

［44］Crawford NP，et al. Rrplb，a new candidate susceptibility gene forbreast cancer progression and metastasis. PLoS Genet，2007，3: e214.

［45］Yang H，et al. Caffeine suppresses metastasis in a transgenicmouse model: a prototype molecule for prophylaxis of metastasis.Clin Exp Metastasis，2004，21: 719-735.

［46］Chesler EJ，et al. Complex trait analysis of gene expressionuncovers polygenic and pleiotropic networks that modulate nervoussystem function. Nat Genet，2005，37: 233-242.

［47］Wang J，et al. WebQTL: web-based complex trait analysis.Neuroinformatics，2003，1: 299-308.

［48］Dey A，et al. A bromodomain protein，MCAP，associates withmitotic chromosomes and affects G( 2 ) -to-M transition. Mol CellBiol，2000，20: 6537-6549.

［49］Houzelstein D，et al. Growth and early postimplantation defects inmice deficient for the bromodomain-containing protein Brd4. MolCell Biol，2002，22: 3794-3802.

［50］Farina A，et al. Bromodomain protein Brd4 binds to GTPaseactivatingSPA-1， modulating its activity and subcellularlocalization. Mol Cell Biol，2004，24: 9059-9069.

［51］Gordon RR， et al. Genotype X diet interactions in micepredisposed to mammary cancer: Ⅱ. tumors and metastasis.Mamm Genome，2008，19: 179-189.

［52］Ben-Eliyahu S. The promotion of tumor metastasis by surgery andstress: immunological basis and implications for psychoneuroimmunology.Brain Behav Immun，2003，17( Suppl 1) : S27-S36.

［53］Weighardt H，et al. Sepsis after major visceral surgery isassociated with sustained and interferon-gamma-resistant defects ofmonocyte cytokine production. Surgery，2000，127: 309-315.

［54］Sietses C，et al. Immunological consequences of laparoscopicsurgery，speculations on the cause and clinical implications.Langenbecks Arch Surg，1999，384: 250-258.

［55］Brittenden J，et al. Natural killer cells and cancer. Cancer，1996，77: 1226-1243.

［56］Benish M，et al. Perioperative use of beta-blockers and COX-2inhibitors may improve immune competence and reduce the risk oftumor metastasis. Ann Surg Oncol，2008，15: 2042-2052.

［57］Bogaerts J，et al. Gene signature evaluation as a prognostic tool:challenges in the design of the MIND ACT trial. Nat Clin PractOncol，2006，3: 540-551.

［58］Irizarry RA，et al. Multiple-laboratory comparison of microarrayplatforms. Nat Methods，2005，2: 345-350.